發(fā)布時(shí)間：2017-10-15 14:01

  本文關(guān)鍵詞：殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞治療小鼠皮膚移植排斥及其對(duì)治療鼠整體免疫功能的影響

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【摘要】：選擇性清除或抑制同種反應(yīng)性T細(xì)胞是治療移植排斥和自身免疫病等的理想策略之一,因?yàn)樗鼙苊饷庖咭种苿┧鶎?dǎo)致的患者整體免疫功能損傷。因此,幾十年來(lái)人們一直在探索各種特異性免疫療法,殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞(Killer artificial antigen presenting cell,KaAPC)就是其中之一。KaAPC是利用基因工程的方法使現(xiàn)有的抗原提呈細(xì)胞表面表達(dá)Fas配體,并通過(guò)細(xì)胞膜上的pMHC分子靶向結(jié)合抗原特異性T細(xì)胞,同時(shí)通過(guò)膜上的FasL與活化后T細(xì)胞膜上的Fas分子結(jié)合從而誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。這種策略對(duì)同種移植排斥、自身免疫病及變態(tài)反應(yīng)等的治療都有很多成功的報(bào)道。然而,殺傷性細(xì)胞療法同時(shí)也遭到強(qiáng)烈的質(zhì)疑：除了生物安全性和原代DC等細(xì)胞的大規(guī)模制備困難外,更重要的是FasL在載體細(xì)胞膜上的表達(dá)水平難以均勻的控制。為了避免細(xì)胞性療法的這些缺陷,近年來(lái)人們轉(zhuǎn)而關(guān)注以非細(xì)胞性物質(zhì)為載體,標(biāo)記pMHC多聚體和FasL,制備靶向殺傷性制劑。這種非細(xì)胞性的KaAPC在體內(nèi)的靶向殺傷效應(yīng)仍少有報(bào)道。本論文利用在人體內(nèi)可生物降解、有組織相容性的聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA)共吸附H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗,制作以H-2kb分子為靶向抗原的KaAPCs,研究其治療小鼠皮膚移植排斥的效果及其對(duì)治療鼠整體免疫功能的影響。結(jié)果顯示：KaAPCs治療能明顯延長(zhǎng)皮膚移植物的存活期,治療鼠的整體免疫功能如抗腫瘤能力和對(duì)第三方供體的同種反應(yīng)能力等也沒有明顯受損。主要結(jié)果如下：1)利用雙乳化劑揮發(fā)法成功制備了表面功能化的、直徑4.5μm的PLGA微球。掃描電鏡、Zeta電位和粒徑分析顯示其具有良好的表征：呈規(guī)則球形,表面完整,61.2%的微球直徑在4.0-5.0μm,平均Zeta(ζ-)電位為36.3mV±6.11mV,分散性好,表面氨基基團(tuán)豐富；BSA和單抗包被實(shí)驗(yàn)顯示其有良好的蛋白負(fù)載能力：對(duì)BSA的最大負(fù)載量為54.2μg/5×106 beads;利用H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗共包被PLGA微球,成功制備以H-2Kb分子為靶向抗原的KaAPCs,單抗染色和流式分析證實(shí)有正確表型。2)以C57BL/6鼠(H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)為皮膚移植的供受體,在移植術(shù)后第5、7、9天經(jīng)尾靜脈分別注射KaAPC、anti-Fas PLGA、Blank PLGA或PBS進(jìn)行分組治療,然后：在第12天取各組脾細(xì)胞膽,CFSE標(biāo)記后在體外與第三方KM鼠的脾細(xì)胞行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)3天和7天,流式分析各族治療鼠GD3+T細(xì)胞群的同種增殖能力；皮膚移植術(shù)后第3天皮下注射SP2/0骨髓瘤細(xì)胞,而后進(jìn)行分組治療,并每天測(cè)量腫瘤大小,第23天時(shí)殺鼠取腫瘤組織,稱重,制冰凍切片后FITC-anti-mouse CD3單抗染色。結(jié)果顯示：KaAPC治療組皮膚移植物的中位存活時(shí)間比對(duì)照組延長(zhǎng)4.5-7天：治療鼠脾臟T細(xì)胞在體外對(duì)第三方小鼠脾細(xì)胞的同種增殖能力無(wú)明顯降低；治療鼠載瘤實(shí)驗(yàn)的成瘤時(shí)間、腫瘤生長(zhǎng)曲線以及腫瘤組織中CD3+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)等與對(duì)照組無(wú)明顯差異。3)以C57BL/6鼠(H-2Kb)和bml鼠(h-2kbml)為皮膚移植的供受體。兩者的遺傳背景只有H-2Kb抗原上三個(gè)氨基酸的差異。這種移植模型將能最大限度地凸顯H-2Kb同種反應(yīng)性T細(xì)胞的清除或抑制對(duì)移植排斥的影響。在皮膚移植術(shù)后第7、9、11天經(jīng)尾靜脈分別注射KaAPC、anti-Fas PLGA、Blank PLGA或PBS進(jìn)行分組治療,然后：在移植術(shù)后第14天取各組脾細(xì)胞,CFSE標(biāo)記后,在體外與第三方BALB/c鼠的脾細(xì)胞行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)3天和7天,流式分析各組治療鼠CD3+T和CD8+T細(xì)胞群的同種反應(yīng)增殖能力；皮膚移植術(shù)后第3天皮下注射B16黑色素瘤細(xì)胞,而后分組治療,并每天測(cè)量腫瘤大小,第23天時(shí)殺鼠取腫瘤組織,稱重,制冰凍切片后APC-anti-mouse CD3以及FITC-anti-mouse CD8單抗染色：在第11天選部分鼠取脾臟細(xì)胞用CFSE標(biāo)記,與Yac-1淋巴瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)4-5h,后用7-AAD染色死亡細(xì)胞,流式分析NK細(xì)胞的殺瘤活性；在第9、11、13天各選部分鼠取脾臟細(xì)胞,用APC-anti-CD3、FITC-Annexin V和PI做三色熒光染色,流式分析各組CD3+T細(xì)胞群中凋亡T細(xì)胞的比例及脾臟中T細(xì)胞的頻率；在第9和13天各選部分鼠取眼眶周圍血,經(jīng)血液分析儀行血常規(guī)分析。結(jié)果顯示：KaAPC治療組皮膚移植物的中位存活時(shí)間比對(duì)照組延長(zhǎng)24.3-27.3天；治療鼠中,脾臟T細(xì)胞在體外對(duì)第三方小鼠脾細(xì)胞的同種增殖能力無(wú)明顯降低：移植瘤的成瘤時(shí)間、腫瘤生長(zhǎng)曲線以及腫瘤組織中CD3+T和CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)等與對(duì)照組無(wú)明顯差異；脾臟NK細(xì)胞的殺瘤能力亦無(wú)顯著下降；在第三次治療后(即第13天),脾臟T細(xì)胞群中凋亡細(xì)胞的比例顯著高于對(duì)照組,T細(xì)胞頻率則顯著低于對(duì)照組；在第三次治療后,外周血中性粒細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著降低,單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量則無(wú)明顯下降。4)利用雙乳化劑揮發(fā)法成功制備了表面功能化的、直徑為450nm以及200nm的PLGA納米球,具有良好的表征：呈規(guī)則球形,表面完整；平均Zeta電位為36.2mV+5.00mV左右；共包被H-2Kb-Ig二聚體和anti-Fas單抗后制成兩種直徑的納米級(jí)KaAPC,經(jīng)PE-anti-H-2Kb單抗和FITC-anti-hamster IgG單抗免疫熒光染色分析證實(shí)其表型正確；在C57BL/6 (H-2Kb)和BALB/c鼠(H-2Kd)為供受對(duì)的皮膚移植模型中,直徑為450nm的KaAPC經(jīng)尾靜脈三次輸注治療未見明顯療效,而直徑為200nm的KaAPC經(jīng)尾靜脈三次輸注治療能明顯延長(zhǎng)皮膚移植物的存活時(shí)間。
【關(guān)鍵詞】：殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞 同種反應(yīng)性T細(xì)胞 同種皮膚移植 聚乳酸-羥基乙酸
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R457.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 主要英文縮寫詞10-13
• 前言13-16
• 文獻(xiàn)綜述 殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞的研究進(jìn)展16-28
• 參考文獻(xiàn)22-28
• 第一章 殺傷性人工抗原提呈細(xì)胞(KaAPC)的制備與表型驗(yàn)證28-40
• 引言28-29
• 1. 材料和試劑29-30
• 2. 方法30-34
• 3. 結(jié)果34-39
• 4. 討論39-40
• 第二章 KaAPC治療BALB/c鼠皮膚移植排斥及其對(duì)整體免疫功能的影響40-55
• 引言40-41
• 1. 材料和試劑41-43
• 2. 方法43-46
• 3. 結(jié)果46-53
• 4. 討論53-55
• 第三章 KaAPC治療bml鼠皮膚移植排斥及其對(duì)整體免疫功能的影響55-82
• 引言55-56
• 1. 材料和試劑56-58
• 2. 方法58-65
• 3. 結(jié)果65-79
• 4. 討論79-82
• 第四章 納米級(jí)KaAPC治療BALB/c鼠皮膚移植排斥的初步研究82-91
• 引言82-83
• 1. 材料和試劑83
• 2. 方法83-85
• 3. 結(jié)果85-90
• 4. 討論90-91
• 小結(jié)與展望91-93
• 參考文獻(xiàn)93-97
• 致謝97-98
• 作者簡(jiǎn)介98

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本文編號(hào)：1037505