本文關鍵詞：細胞因子白介素IL-21分子動力學與生物活性關系研究

  更多相關文章： 白細胞介素21 復性 核磁共振 主鏈歸屬 分子動力學

【摘要】：白細胞介素IL-21由激活的CD4+T細胞、濾泡輔助性T細胞以及自然殺傷T細胞分泌,在先天性免疫以及適應性免疫反應中發(fā)揮出多重效果,其生物學活性則由IL-21與其同源的受體復合物結合從而被激活。最新研究得到IL-21的突變體將人hIL-21CD loop上的氨基酸用IL-4螺旋C上更穩(wěn)定的氨基酸替換,之后激活受體的生物學活性增強十倍。生物活性的基礎在于蛋白質在溶液中的動態(tài)行為,因此對蛋白質在體內動力學變化過程的研究,能夠幫助我們揭示其作用機理。而核磁共振(NMR)技術可以提供分子動力學與分子間相互作用的信息,因此本論文首先通過優(yōu)化復性方法得到具有生物學活性的蛋白質溶液,之后利用核磁共振技術歸屬突變體蛋白hIL-21/hIL-4的主鏈信號,并進行蛋白質分子動力學的弛豫分散實驗,主要內容如下： 1.重組蛋白在大腸桿菌(E. coli)中表達時大部分以包涵體形式存在,為了得到活性蛋白質溶液,成功復性很關鍵。而傳統(tǒng)的分步透析復性常使中間態(tài)存在時間過長,蛋白易聚集。采用優(yōu)化后的兩步稀釋透析復性,顯著提高了透析效率與蛋白產量。之后采集mIL-21蛋白在磷酸鹽buffer(pH8.5)中的一維氫譜,結果顯示蛋白質在溶液中形成正確的三級結構并具有生物活性,對后續(xù)主鏈歸屬奠定了較好的基礎。 2.在優(yōu)化的復性條件基礎之上,得到了15N、13C同位素雙標記的重組嵌合蛋白hIL-21/hIL-4,運用液體高分辨核磁共振技術采集了二維15N-HSQC譜以及三共振譜,對嵌合蛋白的大部分主鏈信號進行了歸屬及解析。 3.通過15N弛豫來研究蛋白質動力學。進行了R2弛豫分散實驗,在射頻場強改變的條件下,采集一系列15N-HSQC譜,對不同弛豫速率R2用三種運動模型進行曲線擬合,擬合結果顯示與hIL-21相比hIL-21/hIL-4嵌合蛋白分子在溶液中的動態(tài)行為發(fā)生了變化,使螺旋C與CD loop區(qū)變得更加穩(wěn)定,有利于增強其激活受體傳導信號的生物學功能。
【關鍵詞】：白細胞介素21 復性 核磁共振 主鏈歸屬 分子動力學
【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R392;O657.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第一章 緒論9-19
• 1.1 研究背景9-10
• 1.2 選題思想10-11
• 1.3 包涵體蛋白及復性技術11-14
• 1.3.1 包涵體的形成及溶解11-12
• 1.3.2 包涵體的復性12-14
• 1.4 核磁共振技術14-16
• 1.4.1 核磁共振在蛋白質溶液結構中的應用14
• 1.4.2 同位素標記的三共振實驗概述14-16
• 1.5 蛋白質分子動力學的NMR研究16-19
• 1.5.1 蛋白質動力學概述16-17
• 1.5.2 R_2弛豫分散實驗17-19
• 第二章 蛋白復性條件的優(yōu)化19-37
• 2.1 引言19
• 2.2 實驗材料19-26
• 2.2.1 質粒和菌株19
• 2.2.2 試劑和儀器19-21
• 2.2.3 實驗流程圖21
• 2.2.4 溶液的配制21-26
• 2.3 實驗部分26-30
• 2.3.1 mIL-21重組蛋白的表達和包涵體的溶解26-27
• 2.3.2 蛋白純化和復性條件的優(yōu)化27-30
• 2.4 結果與討論30-36
• 2.4.1 mIL-21重組蛋白的表達及SDS-PAGE膠的分析30-32
• 2.4.2 純化及復性結果分析32-35
• 2.4.3 一維氫譜分析35-36
• 2.5 本章小結36-37
• 第三章 hIL-21/hIL-4嵌合蛋白蛋白質主鏈信號的歸屬37-49
• 3.1 引言37
• 3.2 實驗材料37-40
• 3.2.1 質粒和菌株37-38
• 3.2.2 試劑和儀器38
• 3.2.3 溶液的配制38-40
• 3.3 實驗部分40-42
• 3.3.1 hIL-21/hIL-4重組蛋白的表達40-41
• 3.3.2 hIL-21/hIL-4嵌合蛋白的純化及透析復性41-42
• 3.3.3 核磁共振所用標記蛋白的表達和純化復性42
• 3.4 結果與討論42-48
• 3.4.1 hIL-21/hIL-4嵌合蛋白的表達及SDS-PAGE膠的分析42-44
• 3.4.2 純化及復性結果分析44-45
• 3.4.3 核磁信號歸屬45-48
• 3.5 本章小節(jié)48-49
• 第四章 hIL-21/hIL-4嵌合蛋白分子動力學研究49-55
• 4.1 引言49
• 4.2 實驗部分49-50
• 4.2.1 NMR實驗樣品制備49-50
• 4.2.2 NMR實驗50
• 4.3 結果與討論50-54
• 4.3.1 構象化學交換快慢的分析50-51
• 4.3.2 R_2弛豫分散實驗結果分析51-54
• 4.4 小結與展望54-55
• 參考文獻55-61
• 致謝61

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前7條

1 廖新麗,林東海;用異核多維NMR技術研究蛋白質動力學[J];波譜學雜志;2004年04期

2 宣勁松;王金鳳;;核磁共振研究中蛋白質樣品的同位素標記策略[J];波譜學雜志;2008年03期

3 胡蘊菲;金長文;;蛋白質溶液結構及動力學的核磁共振研究[J];波譜學雜志;2009年02期

4 文yN;林東海;;基于NMR自旋弛豫技術的蛋白質動力學研究[J];波譜學雜志;2012年02期

5 方敏,黃華j;包涵體蛋白體外復性的研究進展[J];生物工程學報;2001年06期

6 王增;馬會勤;張文;陳尚武;;包涵體蛋白的分離和色譜法體外復性純化研究進展[J];中國生物工程雜志;2009年07期

7 田永菊;崔保霞;;白細胞介素21抗腫瘤作用的研究進展[J];腫瘤;2010年03期

，

本文編號：1033706