本文關(guān)鍵詞：T細(xì)胞CD59GPI對LAT脂筏內(nèi)移位及跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： CD59 T細(xì)胞活化連接蛋白 棕櫚�；� T淋巴細(xì)胞

【摘要】：目的構(gòu)建T細(xì)胞活化連接蛋白(LAT)-EGFP融合蛋白真核表達(dá)載體,以及利用基因點(diǎn)突變技術(shù)使LAT-EGFP的棕櫚酰化位點(diǎn)突變構(gòu)建LAT-EGFP-M真核表達(dá)載體,并將兩種真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入Jurkat細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),研究CD59在T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中與LAT的相互作用,探討CD59向胞內(nèi)傳遞信號的機(jī)制。 方法從人T細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat細(xì)胞中提取總RNA,利用RT-PCR的方法擴(kuò)增LAT基因,構(gòu)建LAT-EGFP真核表達(dá)載體,并利用點(diǎn)突變技術(shù)使LAT-EGFP近膜處的棕櫚�；稽c(diǎn)的絡(luò)氨酸替換為甘氨酸,構(gòu)建棕櫚酰化位點(diǎn)突變的LAT-EGFP-M真核表達(dá)載體：采用電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞,雙抗交聯(lián)CD59后,熒光共聚焦顯微鏡下觀察LAT分布情況的變化：用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測抗體交聯(lián)前各組后Jurkat細(xì)胞增殖情況差別；應(yīng)用ELISA檢測各組細(xì)胞上清中IL-2的變化水平；用Western blot技術(shù)檢測抗體交聯(lián)后LAT-EGFP和LAT-EGFP-M的磷酸化程度。 結(jié)果經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、western blot技術(shù)及測序鑒定LAT-EGFP真核表達(dá)載體和LAT-EGFP-M構(gòu)建成功；抗體交聯(lián)CD59之后,LAT-EGFP-M較LAT-EGFP相比不能定位聚集于CD59所在的脂筏區(qū)域,并且轉(zhuǎn)染了突變LAT-EGFP-M質(zhì)粒的Jurkat細(xì)胞增增速度和IL-2分泌能力低于轉(zhuǎn)染LAT-EGFP質(zhì)粒的對照組。轉(zhuǎn)染空載體EGFP-N3及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,LAT-EGFP-M的磷酸化程度遠(yuǎn)低]LAT-EGFP。 結(jié)論LAT參與CD59信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,并且二者作用位點(diǎn)與棕櫚酰化基團(tuán)有關(guān)。這為研究CD59類GPI錨固蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：CD59 T細(xì)胞活化連接蛋白 棕櫚�；� T淋巴細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392.12
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-6
• 引言6-7
• 第1章 材料與方法7-20
• 1.1 材料7-8
• 1.1.1 主要儀器設(shè)備7
• 1.1.2 質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞株7
• 1.1.3 主要實驗試劑7-8
• 1.2 方法8-20
• 1.2.1 LAT-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建8-15
• 1.2.1.1 PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計8
• 1.2.1.2 Jurkat細(xì)胞的培養(yǎng)8
• 1.2.1.3 Jurkat細(xì)胞內(nèi)總RNA的提取8-9
• 1.2.1.4 目的基因的擴(kuò)增9-10
• 1.2.1.5 LAT-T重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定10-12
• 1.2.1.6 LAT-EGFP重組載體的構(gòu)建和鑒定12-15
• 1.2.2 Jurkat細(xì)胞的轉(zhuǎn)染15-17
• 1.2.2.1 Jurkat細(xì)胞的培養(yǎng)15
• 1.2.2.2 Jurkat細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染15-16
• 1.2.2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞陽性克隆的鑒定16-17
• 1.2.3 功能檢測17-19
• 1.2.3.1 Jurkat細(xì)胞固定觀察LAT-EGFP,LAT-EGFP-M與CD59在細(xì)胞膜上的自然分布情況17-18
• 1.2.3.2 抗體交聯(lián)CD59后激光共聚焦顯微鏡下觀察LAT-EGFP,LAT-EGFP-M與CD59在細(xì)胞膜上的分布變化18
• 1.2.3.3 MTT比色法檢測Jurkat細(xì)胞增殖活性18
• 1.2.3.4 IL-2 ELISA的檢測18-19
• 1.2.3.5 Western blot法檢測19
• 1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析19-20
• 第2章 實驗結(jié)果20-27
• 2.1 LAT-EGFP重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建20-22
• 2.1.1 LAT基因片段的擴(kuò)增20
• 2.1.2 LAT-T克隆載體的PCR及酶切鑒定20-21
• 2.1.3 PEGFP-N3-Linker的單酶切鑒定21
• 2.1.4 陽性重組質(zhì)粒LAT-EGFP的PCR及酶切鑒定21-22
• 2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞及鑒定22-24
• 2.2.1 重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞后觀察熒光量表達(dá)22
• 2.2.2 LAT-EGFP融合基因在RNA水平上的表達(dá)鑒定22-23
• 2.2.3 共聚焦顯微鏡下觀察LAT-EGFP的分布23
• 2.2.4 Western blot鑒定融合蛋白的表達(dá)23-24
• 2.3 功能檢測結(jié)果24-27
• 2.3.1 轉(zhuǎn)染后固定的Jurkat細(xì)胞上CD59和LAT-EGFP,LAT-EGFP-M分布情況24-25
• 2.3.2 抗體交聯(lián)CD59后觀察膜上分子的分布變化25
• 2.3.3 MTT檢測結(jié)果25-26
• 2.3.4 IL-2 ELISA檢測結(jié)果26
• 2.3.5 Western blot的結(jié)果26-27
• 第3章 討論27-30
• 結(jié)論30-31
• 參考文獻(xiàn)31-34
• 綜述34-45
• 綜述參考文獻(xiàn)40-45
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果45-46
• 附錄146-50
• 附錄250-52
• 致謝52-53

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 高美華;鐘丹丹;張蓓;;CD59-CD2對T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[J];免疫學(xué)雜志;2011年09期

2 王娟;高美華;張蓓;;CD59錨定蛋白對CD3介導(dǎo)Jurkat細(xì)胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的增強(qiáng)效應(yīng)[J];免疫學(xué)雜志;2011年11期

3 高美華;王美娟;張蓓;解西河;王冰;;CD46 RNAi對CD59介導(dǎo)的T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用研究[J];免疫學(xué)雜志;2012年07期

4 王文舉;李鴻鈞;孫茂盛;;脂筏與T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[J];生命科學(xué);2007年05期

5 聊菲;高美華;張蓓;;CD59錨定蛋白對CD55介導(dǎo)的T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強(qiáng)效應(yīng)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年02期

，

本文編號：1032785