發(fā)布時間：2017-10-13 13:17

  本文關(guān)鍵詞：21三體綜合征誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系的建立及誘導(dǎo)神經(jīng)分化的研究

  更多相關(guān)文章： 21三體綜合征 羊水細(xì)胞 皮膚成纖維細(xì)胞 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 神經(jīng)分化

【摘要】：【研究背景】 21三體綜合征又稱為唐氏綜合征（Down’s syndrome,DS）或先天愚型，是常見的由常染色體變異導(dǎo)致中至重度智力障礙等多種臨床表現(xiàn)的疾病。在我國該病的發(fā)生率占出生人數(shù)的1/600～1/800，占受孕人數(shù)的1/150。由于該病的基因表達(dá)的復(fù)雜性、表型的多樣性以及個體間的差異，使該疾病的發(fā)病機(jī)制一直未能被完全解釋。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells or iPSCs）是一類將特定轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入分化成熟的體細(xì)胞后使其發(fā)生重編程而形成的具有多能性的干細(xì)胞。特異疾病的iPSCs研究很大程度地保留了成體細(xì)胞基因組的遺傳信息，并且iPSCs能通過細(xì)胞分裂維持細(xì)胞數(shù)量，為疾病的研究提供了真實(shí)的體外細(xì)胞模型并解決了疾病研究的細(xì)胞供源問題。iPSCs同時具有向各類型組織細(xì)胞分化的潛能，其分化為特定的靶細(xì)胞可為特異疾病發(fā)病機(jī)制的研究提供標(biāo)本和完整的發(fā)育模型，為研究DS等染色體疾病提供了一種新的有利的工具。 【目的】 建立羊水細(xì)胞及皮膚成纖維細(xì)胞來源的21三體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系（Trisomy21human amniotic fluid induced pluripotent stem cells,T21hAF-iPSCs and Trisomy21human dermal fibroblasts induced pluripotent stem cells,T21hDF-iPSCs），比較兩種細(xì)胞來源的建系效率，為疾病的機(jī)制研究提供理想細(xì)胞模型，同時研究21三體綜合征誘導(dǎo)多能干細(xì)胞從全能性細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過程。 【方法】 1.本研究利用慢病毒介導(dǎo)4種轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）分別誘導(dǎo)建立了羊水細(xì)胞及患兒皮膚成纖維細(xì)胞來源的21三體綜合征誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系，并通過堿性磷酸酶染色、免疫熒光染色、qPCR檢測基因表達(dá)等方法鑒定其多能性。 2.利用EB懸浮培養(yǎng)法對細(xì)胞進(jìn)行體外分化，用PCR檢測各胚層特有基因的表達(dá)情況，并各取1×107個T21-iPSCs注射到SCID小鼠皮下，，6周后得到畸胎瘤，行HE染色，觀察iPSCs在體內(nèi)的分化情況。 3.T21-iPSCs每傳10代重復(fù)一次核型分析，檢測T21-iPSCs遺傳性狀的穩(wěn)定情況。 4.1×105個感染后的兩種來源細(xì)胞接種在飼養(yǎng)層上，比較出現(xiàn)克隆的時間長短；在25天進(jìn)行堿性磷酸酶染色，得到出現(xiàn)陽性克隆的效率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 5.對T21-iPSCs及正常人iPSCs利用EB誘導(dǎo)法進(jìn)行體外神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，進(jìn)行免疫熒光染色并比較陽性率；獲得神經(jīng)干細(xì)胞后添加特定細(xì)胞因子進(jìn)一步誘導(dǎo)其向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，進(jìn)行免疫熒光染色并通過特異蛋白陽性表達(dá)來比較分化效率。 【結(jié)果】 1.分別建立了羊水細(xì)胞及皮膚成纖維細(xì)胞來源的21三體綜合征的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系，通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞特異性表面抗原Oct4、Nanog、TRA-1-60、SSEA-4染色陽性；qPCR檢測的T21-iPSCs內(nèi)源性多能性基因Nanog、Oct4已被激活，與正常人ES細(xì)胞表達(dá)水平相似；在持續(xù)傳代過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)穩(wěn)定，核型檢測發(fā)現(xiàn)T21-iPSCs在傳代過程中能維持異常核型；畸胎瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)T21-iPSCs形成的畸胎瘤可分化為三個胚層。 2.約1×105個感染后的兩種類型細(xì)胞接種在飼養(yǎng)層上，羊水細(xì)胞在5-7天時出現(xiàn)了胚胎干細(xì)胞樣的克隆，而皮膚成纖維細(xì)胞在13-15天出現(xiàn)克隆。在25天進(jìn)行堿性磷酸酶染色，羊水細(xì)胞來源的得到285個陽性克隆，效率為0.285%。皮膚成纖維細(xì)胞得到27個克隆，效率為0.027%。經(jīng)X2檢驗(yàn)P0.05，誘導(dǎo)羊水細(xì)胞與皮膚成纖維細(xì)胞形成多能性干細(xì)胞的效率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.對T21-iPSCs進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)分化，T21-iPSCs與正常人iPSCs體外分化神經(jīng)干細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示Nestin、Pax6呈陽性，比較誘導(dǎo)效率無顯著差異。繼續(xù)將神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為三種神經(jīng)細(xì)胞系，細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示三種神經(jīng)細(xì)胞系的表面標(biāo)志Tuj1、GFAP和O4的表達(dá)為陽性。在分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的效率方面，T21-iPSCs與對照組相比無顯著差異。 【結(jié)論】 1.21三體綜合征疾病的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系在體外長期傳代中能維持異常核型及干細(xì)胞多能性，可作為DS研究的細(xì)胞模型； 2.利用羊水細(xì)胞建立T21-iPSCs效率高于皮膚成纖維細(xì)胞，羊水細(xì)胞可能是制備T21-iPSCs的理想細(xì)胞類型； 3.T21-iPSCs在神經(jīng)分化過程中，向神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的效率與正常的iPSCs相比無顯著差異。
【關(guān)鍵詞】：21三體綜合征 羊水細(xì)胞 皮膚成纖維細(xì)胞 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 神經(jīng)分化
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-9
• 英文縮寫詞匯表9-10
• 1.前言10-12
• 2.材料與方法12-26
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料12-15
• 2.1.1 細(xì)胞來源12
• 2.1.2 主要儀器與設(shè)備12-13
• 2.1.3 主要試劑13-14
• 2.1.4 常用試劑配制14-15
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法15-26
• 2.2.1 目的細(xì)胞的培養(yǎng)15-16
• 2.2.2 飼養(yǎng)層的制備16-17
• 2.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)17-18
• 2.2.4 iPSCs 的培養(yǎng)18-19
• 2.2.5 核型分析19-20
• 2.2.6 21 三體綜合征 iPS 細(xì)胞（T21-iPSCs）多能性的鑒定20-25
• 2.2.7 神經(jīng)分化25
• 2.2.8 統(tǒng)計(jì)分析25-26
• 3.結(jié)果與分析26-39
• 3.1 21 三體綜合征羊水細(xì)胞及皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)26
• 3.2 慢病毒誘導(dǎo) 21 三體綜合征羊水細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生 iPSCs26-29
• 3.2.1 T21-iPSCs 細(xì)胞形態(tài)與 ES 細(xì)胞相似27-28
• 3.2.2 誘導(dǎo)效率的比較28-29
• 3.3 T21-iPSCs 核型分析29-30
• 3.4 T21-iPSCs 多能性的鑒定30-35
• 3.4.1 T21-iPSCs 堿性磷酸酶染色30-31
• 3.4.2 T21-iPSCs 免疫熒光染色31
• 3.4.3 檢測 T21-iPSCs 胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因及四種外源性基因的表達(dá)情況31-33
• 3.4.4 T21-iPSCs 體外分化能力的檢測33-34
• 3.4.5 T21-iPSCs 體內(nèi)分化能力的檢測34-35
• 3.5 T21-iPSCs 定向誘導(dǎo)神經(jīng)分化35-39
• 3.5.1 向神經(jīng)干細(xì)胞分化35-37
• 3.5.2 神經(jīng)干細(xì)胞向三種神經(jīng)細(xì)胞系的分化37-39
• 4.討論39-43
• 4.1 兩種細(xì)胞來源的 21 三體綜合征誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系的建立39-41
• 4.2 體外誘導(dǎo) T21-iPSCs 向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞分化41-43
• 5.結(jié)論43-44
• 6.參考文獻(xiàn)44-46
• 綜述46-54
• 參考文獻(xiàn)52-54
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果54-55
• 致謝55-56

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張雷鳴;張劍寧;;誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究[J];中華神經(jīng)外科疾病研究雜志;2009年05期

2 李拉;;直接轉(zhuǎn)入重新編碼蛋白誘導(dǎo)多能干細(xì)胞產(chǎn)生[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2011年05期

3 楊夢晗;化冰;池亞菲;王超;;誘導(dǎo)多能干細(xì)胞研究進(jìn)展[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2012年01期

4 毛潤一;王t

本文編號：1025044