本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌HtpG蛋白的表達(dá)純化、結(jié)晶及其與CrRNA的相互作用

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【摘要】：目前由世界衛(wèi)生組織報(bào)道，在2010年，全世界900萬(wàn)人患結(jié)核病，140萬(wàn)人死亡，而這其中95%發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。我國(guó)每年新發(fā)結(jié)核病人數(shù)占全球總數(shù)的17%，位居世界第二。因此,對(duì)于結(jié)核病的病原體——結(jié)核分枝桿菌——的致病機(jī)理以及免疫機(jī)制展開(kāi)深入研究顯得尤為重要。 HtpG是原核生物重要的分子伴侶，在抵御外界壓力的過(guò)程中有著重要的作用。它是hsp90的原核同源物。Hsp90使生物有效抵御環(huán)境壓力。其獨(dú)特的性質(zhì)使它成為治療的良好分子靶點(diǎn)。對(duì)于HtpG及其在結(jié)核分枝桿菌中的深入研究可以對(duì)結(jié)核病的治療以及防治提供新的思路。 CRISPR系統(tǒng)是結(jié)核分枝桿菌中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，對(duì)菌體消滅外來(lái)質(zhì)粒和噬菌體以及抵抗和阻止質(zhì)粒及噬菌體的繁殖有著不可忽視的作用。近年來(lái)有報(bào)道稱(chēng)，HtpG對(duì)大腸桿菌中的CRISPR/Cas（CRISPR-associated）系統(tǒng)是必需的。如果HtpG缺失，CRISPR系統(tǒng)將丟失在溶原作用中抵御噬菌體的感染的自殺行動(dòng)并且丟失了免疫能力。然而，，當(dāng)HtpG被回補(bǔ)后，CRISPR/Cas系統(tǒng)丟失的活性得到了恢復(fù)。 依據(jù)現(xiàn)有的一些研究成果，預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌中同樣存在CRISPR系統(tǒng)，并且HtpG對(duì)CRISPR系統(tǒng)的活性有作用。結(jié)核分枝桿菌中Rv2299c基因?qū)?yīng)的蛋白即HtpG。本文據(jù)此，在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，提取結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的基因組作為模板，對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株中的Rv2299c基因進(jìn)行克隆以及融合表達(dá)，構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Rv2299c，并且在原核中高效表達(dá)。對(duì)純化后的融合蛋白進(jìn)行了結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，初篩長(zhǎng)出來(lái)了棒狀晶體。同時(shí)，將Rv2299c連接到了穿梭載體pMV261H中，并轉(zhuǎn)入了恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis），采用抗his標(biāo)簽的抗體檢測(cè)重組子已正確表達(dá)HtpG蛋白。 在CRISPI數(shù)據(jù)庫(kù)得到結(jié)核分枝桿菌H37Rv的CRISPR的預(yù)測(cè)序列，選取一段CRISPR的序列，在RNA fold web server中預(yù)測(cè)其RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)合成模板，PCR擴(kuò)增后在體外轉(zhuǎn)錄成RNA。RNA經(jīng)過(guò)純化后將其進(jìn)行去磷酸化處理，使用T4多聚核苷酸激酶在5’端加上γ-~(32)P ATP標(biāo)記后，與HtpG蛋白進(jìn)行孵育。經(jīng)非變性膠檢測(cè)，放射性顯影確定了HtpG蛋白和所選取的CRISPR的序列有相互結(jié)合的作用。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 高溫蛋白G 定期間隔開(kāi)的短回文重序列叢集 CrRNA
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 目錄5-9
• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 英文縮寫(xiě)表13-15
• 1 文獻(xiàn)綜述15-25
• 1.1 結(jié)核病15-16
• 1.1.1 世界結(jié)核病疫情15
• 1.1.2 我國(guó)結(jié)核病疫情15
• 1.1.3 結(jié)核病簡(jiǎn)介15-16
• 1.1.4 結(jié)核病分類(lèi)16
• 1.1.5 結(jié)核病歷史16
• 1.2 結(jié)核分枝桿菌16-18
• 1.2.1 結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)17
• 1.2.2 結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁成分17
• 1.2.3 結(jié)核分枝桿菌的抗酸染色17
• 1.2.4 結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)特性17-18
• 1.2.5 結(jié)核分枝桿菌的生化特點(diǎn)18
• 1.2.6 結(jié)核分枝桿菌的抵抗力18
• 1.2.7 結(jié)核分枝桿菌的對(duì)抗藥物18
• 1.3 熱休克蛋白18-21
• 1.3.1 熱休克蛋白的簡(jiǎn)介18-19
• 1.3.2 熱休克蛋白 90 的結(jié)構(gòu)19-20
• 1.3.3 熱休克蛋白 90 的功能20-21
• 1.4 CRISPR/Cas 系統(tǒng)21-24
• 1.4.1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的簡(jiǎn)介21-22
• 1.4.2 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)22-23
• 1.4.3 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的功能23
• 1.4.4 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的作用過(guò)程23-24
• 1.5 本研究的目的和意義24-25
• 2 結(jié)核分枝桿菌 HtpG 蛋白的表達(dá)和純化25-48
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-28
• 2.1.1 質(zhì)粒25
• 2.1.2 菌株25
• 2.1.3 培養(yǎng)基25
• 2.1.4 主要試劑25-26
• 2.1.5 常用緩沖液及其它溶液26-27
• 2.1.6 主要儀器27-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-38
• 2.2.1 Rv2299c 基因編碼的蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析28
• 2.2.2 Rv2299c 基因的克隆28-30
• 2.2.3 重組質(zhì)粒 pET28a- Rv2299c 和 pMV261H- Rv2299c 的構(gòu)建和鑒定30-33
• 2.2.4 重組質(zhì)粒 pET28a-Rv2299c 在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)與純化33-34
• 2.2.5 重組質(zhì)粒 pMV261H-Rv2299c 在恥垢分枝桿菌的轉(zhuǎn)化與鑒定34-35
• 2.2.6 重組質(zhì)粒 pMV261H-Rv2299c 在恥垢分枝桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及 WB 鑒定35-37
• 2.2.7 His-HtpG 融合蛋白的結(jié)晶及初步衍射37-38
• 2.3 結(jié)果和分析38-46
• 2.3.1 Rv2299c 基因編碼的蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析38
• 2.3.2 結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 基因組提取38-39
• 2.3.3 目的基因 Rv2299c 的 PCR 擴(kuò)增39
• 2.3.4 pET28a-Rv2299c 和 pMV261H- Rv2299c 重組載體初步驗(yàn)證39-40
• 2.3.5 pET28a-Rv2299c 和 pMV261H-Rv2299c 重組載體測(cè)序驗(yàn)證40-41
• 2.3.6 His- HtpG 融合蛋白的表達(dá)和純化41-43
• 2.3.7 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定43-44
• 2.3.8 重組質(zhì)粒 pMV261H-Rv2299c 在恥垢分枝桿菌中的 PCR 鑒定44-45
• 2.3.9 重組質(zhì)粒 pMV261H-Rv2299c 在恥垢分枝桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)的 WB 鑒定45
• 2.3.10 His-HtpG 融合蛋白結(jié)晶及晶體的初步衍射分析45-46
• 2.4 討論46-48
• 3 CrRNA 的制備48-58
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料48-49
• 3.1.1 主要試劑48
• 3.1.2 常用溶液48-49
• 3.1.3 主要儀器49
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法49-53
• 3.2.1 目的基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)49
• 3.2.2 模板的制備49-50
• 3.2.3 引物的合成50
• 3.2.4 目的基因的擴(kuò)增和純化50-51
• 3.2.5 目的基因的轉(zhuǎn)錄51-52
• 3.2.6 CrRNA 的 PAGE 檢測(cè)52
• 3.2.7 CrRNA 的純化52-53
• 3.3 結(jié)果和分析53-56
• 3.3.1 目的基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)53-54
• 3.3.2 目的基因的 PCR 擴(kuò)增54-55
• 3.3.3 目的基因的轉(zhuǎn)錄55
• 3.3.4 目的基因的純化55-56
• 3.4 討論56-58
• 3.4.1 模板的制備56
• 3.4.2 引物的合成56-57
• 3.4.3 目的基因的 PCR 擴(kuò)增57
• 3.4.4 目的基因的轉(zhuǎn)錄和純化57-58
• 4 HtpG 蛋白與 CrRNA 的結(jié)合作用58-63
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料58-59
• 4.1.1 主要試劑58
• 4.1.2 常用緩沖液及其它溶液58-59
• 4.1.3 主要儀器59
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法59-61
• 4.2.1 CrRNA 的去磷酸化處理59
• 4.2.2 CrRNA 的同位素標(biāo)記59-60
• 4.2.3 標(biāo)記后的 RNA 與蛋白的孵育60
• 4.2.4 非變性的聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)60-61
• 4.2.5 同位素放射自顯影61
• 4.3 結(jié)果和分析61-62
• 4.4 討論62-63
• 5 結(jié)論與展望63-64
• 參考文獻(xiàn)64-72
• 致謝72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 王菲;羅恩杰;;CRISPR及其在原核生物防御系統(tǒng)中的作用[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2008年10期

2 王黎霞;成詩(shī)明;陳明亭;趙雁林;張慧;姜世聞;何廣學(xué);呂青;杜昕;陳偉;劉小秋;阮云洲;王勝芬;夏aa;于蘭;李峻;李雪;;2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J];中國(guó)防癆雜志;2012年08期

本文編號(hào)：1021753