發(fā)布時(shí)間：2017-10-12 22:14

  本文關(guān)鍵詞：Tregs與Th17相關(guān)細(xì)胞因子在肌炎模型小鼠中表達(dá)的研究

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【摘要】：特發(fā)性炎癥性肌病（IIM）是一組異質(zhì)性的急性、亞急性或慢性起病的罕見(jiàn)的獲得性骨骼肌炎性疾病。其臨床表現(xiàn)為肌肉無(wú)力，肌酸激酶升高，肌電圖非特異性異常等，常累及多臟器病變，病變嚴(yán)重時(shí)危及生命[1-3]，目前其確切發(fā)病機(jī)制不清。根據(jù)臨床病理特征主要將其分為多發(fā)性肌炎（PM）、皮肌炎（DM）、包涵體肌炎（IBM）和免疫介導(dǎo)的壞死性肌炎（IMNM）。 由于多發(fā)性肌炎的發(fā)病機(jī)制不清，治療效果不理想，因此我們擬通過(guò)肌炎動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行研究。目前較好的動(dòng)物模型是肌漿球蛋白誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎（EAM）模型，其在多個(gè)方面都與PM[4]相似，為我們研究IIM提供了良好的基礎(chǔ)。本研究中采用的模型為我們前期通過(guò)改變肌球蛋白注射劑量和注射輔劑的時(shí)間得到的改良EAM模型，其特點(diǎn)為用時(shí)短、重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定可靠。我們前期的研究中觀察EAM模型2個(gè)月，發(fā)現(xiàn)炎癥逐步加重，在14天時(shí)炎癥最嚴(yán)重，然后炎癥稍有減弱，28天后基本成穩(wěn)定的炎癥狀態(tài)，因此我們選擇0天、14天和28天3個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 大量的報(bào)道證實(shí)，Tregs和Th17細(xì)胞之間的失衡與多種自身免疫性疾病有關(guān)[5-7]。Tregs是在自身免疫性疾病中的起保護(hù)作用的細(xì)胞，Th17細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)各種促炎反應(yīng)增強(qiáng)自身免疫反應(yīng)的進(jìn)展。但這些研究都沒(méi)有闡明PM中，Tregs和Th17細(xì)胞之間到底如何變化？故本研究通過(guò)觀察Tregs和Th17相關(guān)的細(xì)胞因子的變化情況，嘗試發(fā)現(xiàn)這些因子在肌炎發(fā)病過(guò)程中的可能作用。 目的 觀察Tregs的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及相關(guān)的細(xì)胞因子（IL-10、TGF-β）和Th17相關(guān)的細(xì)胞因子（IL-6、IL-17、IL-23）在EAM發(fā)病過(guò)程中的變化規(guī)律，探討這些因子在肌炎中的可能作用以及這些因子與兩種細(xì)胞的相關(guān)性，從而嘗試找出調(diào)節(jié)兩種細(xì)胞變化的關(guān)鍵因子。 方法 將健康成年雌性BALB/c小鼠（體重15~18g，5~6周齡）隨機(jī)分為3組，每組5只：第一組為0天處理組（正常組)，第二組為EAM14天處理組，第三組為EAM28天處理組。進(jìn)行肌力測(cè)定和組織病理學(xué)評(píng)分；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠肌肉和脾臟中Tregs的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及相關(guān)的細(xì)胞因子（IL-10、TGF-β）和Th17相關(guān)的細(xì)胞因子（IL-6、IL-17、IL-23）mRNA的表達(dá)水平；采用Luminex液相芯片技術(shù)檢測(cè)小鼠血清中IL-6，IL-17和TGF-β1的表達(dá)水平。 結(jié)果 1．0天處理組小鼠肌力均超過(guò)30分鐘，EAM處理組小鼠肌力均明顯下降，以EAM14天處理組肌力下降最明顯，三組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01）；組織病理學(xué)評(píng)分：0天處理組0分，EAM14天處理組3.05±0.190分，EAM28天處理組1.85±0.105分，在14天時(shí)炎癥最為嚴(yán)重，28天時(shí)略有好轉(zhuǎn)（P0.01）。通過(guò)光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，0天處理組小鼠的肌纖維是多角形，大小基本一致，細(xì)胞核多位于肌纖維周邊，I型（深染）與II型（淺染）肌纖維清晰可見(jiàn)；EAM14天處理組小鼠的肌纖維大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維大小不等，可見(jiàn)散在分布的壞死、再生纖維；EAM28天處理組小鼠的肌纖維炎癥程度稍減輕，但仍有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。 2．在小鼠肌肉組織的mRNA中，Tregs相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在0天時(shí)表達(dá)較低（0.697±0.322），在14天時(shí)略有升高（1.274±0.547），在28天時(shí)顯著增加（16.491±7.884）；IL-10在0天時(shí)表達(dá)較低（1.010±0.479），在14天時(shí)顯著增加（5.670±2.979），28天時(shí)下降（2.648±0.633）；TGF-β在0天時(shí)表達(dá)較高（0.576±0.250），在14天時(shí)有所下降（0.358±0.186），在28天時(shí)顯著降低（0.094±0.075）。Th17相關(guān)的細(xì)胞因子IL-6、IL-17和IL-23變化規(guī)律從0→14→28天都為持續(xù)上升趨勢(shì)，28天增高最為顯著（IL-6：0.459±0.308，0.636±0.113，1.477±0.224；IL-17：0.718±0.208，2.197±0.295，19.237±2.126；IL-23：0.754±0.296，2.035±1.050，20.158±11.188）。 3．在小鼠脾臟組織的mRNA中，Tregs相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3從0→14→28天為持續(xù)增高，28天增高最顯著（0天：1.017±0.080；14天：1.908±0.675；28天：4.992±1.924）。相反，其相關(guān)的細(xì)胞因子IL-10和TGF-β則均為下降趨勢(shì)，14天時(shí)就下降顯著，28天繼續(xù)降低（IL-10：0.994±0.147,0.223±0.057,0.183±0.043；TGF-β：0.697±0.188,0.063±0.104,0.063±0.058）。Th17相關(guān)的細(xì)胞因子IL-6在0天時(shí)表達(dá)較高（0.507±0.384），在14天時(shí)顯著下降（0.066±0.163），在28天時(shí)略有升高（0.167±0.069）；IL-17在0天時(shí)表達(dá)較低（1.269±0.293），在14天時(shí)略有升高（2.681±0.305），在28天時(shí)顯著增加（10.252±1.672）；IL-23無(wú)明顯變化。 4．在小鼠血清中， IL-6，IL-17和TGF-β1的表達(dá)水平三者均為在0天時(shí)最低，14天時(shí)達(dá)到高峰，28天時(shí)有所下降，但仍高于0天，與肌肉組織的炎癥程度一致。（IL-6:0，35.840±3.094，3.740±1.108；IL-17：0，35.130±5.524，10.120±3.579；TGF-β1：2413.100±223.563，3861.600±317.621，2895.800±366.154）。 結(jié)論 1.在EAM的發(fā)病過(guò)程中，Tregs的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及相關(guān)的細(xì)胞因子IL-10、TGF-β和Th17相關(guān)的細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-23都有不同的顯著變化，總的趨勢(shì)為前者下降，，后者增高，提示Tregs和Th17之間的失衡在肌炎發(fā)病機(jī)制中起重要作用。 2.在肌炎的14天升高的細(xì)胞因子有IL-10和IL-17，說(shuō)明其在早期的炎癥反應(yīng)時(shí)發(fā)揮重要作用；在28天時(shí)仍升高的細(xì)胞因子有IL-6、IL-17、IL-23，說(shuō)明這些細(xì)胞因子可能與炎癥的持續(xù)發(fā)展有關(guān)。 3.在肌炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，小鼠脾臟中的IL-6、IL-10和TGF-β逐步降低，提示脾臟作為T(mén)淋巴細(xì)胞的增殖場(chǎng)所，調(diào)控體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的分布，使T淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)再循環(huán)后重新分布，使這些因子向肌肉炎癥部位歸巢，從而發(fā)揮其免疫作用，說(shuō)明脾臟在肌炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。 4.在肌肉組織炎癥發(fā)展過(guò)程中，IL-6逐步上升，TGF-β逐步下降，在14天時(shí)可能達(dá)到合適比例發(fā)揮其最大的作用，在兩者共同作用下，導(dǎo)致14天后IL-17迅速顯著增高，28天時(shí)達(dá)到最高，提示IL-6的增加可能使初始T細(xì)胞更多的轉(zhuǎn)化為T(mén)h17細(xì)胞，所以通過(guò)阻斷IL-6，可能為治療肌炎提供了一個(gè)理想的治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：特發(fā)性炎癥性肌病 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 Th17細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R746;R-332
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-18
• 文獻(xiàn)回顧18-30
• 實(shí)驗(yàn)30-49
• 1 材料30-32
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30
• 1.2 主要試劑30
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器30-31
• 1.4 主要溶液的配制方法31-32
• 2 方法32-37
• 2.1 豚鼠肌漿球蛋白的提取32
• 2.2 小鼠分組及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽?/span>32-33
• 2.3 小鼠肌力的測(cè)定33
• 2.4 樣本的收集及制備33-34
• 2.5 組織病理學(xué)檢測(cè)（H-E 染色）34
• 2.6 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)目的基因的表達(dá)34-36
• 2.7 Luminex 液相芯片技術(shù)檢測(cè)多種細(xì)胞因子（IL-6,IL-17, TGF-β1）的步驟36-37
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析37
• 3 結(jié)果37-46
• 3.1 小鼠的一般狀態(tài)37
• 3.2 小鼠肌力的變化情況37-38
• 3.3 小鼠肌肉組織病理學(xué)評(píng)分38-39
• 3.4 小鼠脾臟的大體觀察39-40
• 3.5 小鼠肌肉和脾臟中與 Tregs 相關(guān)的 Foxp3、IL-10 和 TGF-β mRNA 的表達(dá)水平40-42
• 3.6 小鼠肌肉和脾臟中與 Th17 細(xì)胞相關(guān)的 IL-6、IL-17 和 IL-23 mRNA 的表達(dá)水平42-45
• 3.7 小鼠血清中多種細(xì)胞因子（IL-6,IL-17,TGF-β1）的表達(dá)水平45-46
• 4 討論46-49
• 小結(jié)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-61
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果61-62
• 致謝62

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 康娟;韓文娟;張紅鴨;賈宏閣;;誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性肌炎模型并觀察調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)及意義[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年03期

2 Emilio Cuadrado;Marta Alonso;Maria Dolores de Juan;Pilar Echaniz;Juan Ignacio Arenas;;Regulatory T cells in patients with inflammatory bowel diseases treated with adacolumn granulocytapheresis[J];World Journal of Gastroenterology;2008年10期

本文編號(hào)：1021203