本文關(guān)鍵詞：CHD2調(diào)控大腦皮層發(fā)育過程中神經(jīng)前體細胞的增殖與分化

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【摘要】：在真核生物中,染色質(zhì)動力學(xué)研究在生物學(xué)尤其是在發(fā)育生物學(xué)備受人們關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)大部分ATP依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物通過結(jié)合廣譜表達的基因啟動子或者特異性基因的啟動子從而調(diào)控染色質(zhì)的動力學(xué)變化,進而調(diào)控真核生物基因表達。 CHD家族蛋白(染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白)是一類含有染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域(chromodomains, chromatin organization modifier)、SNF2相關(guān)解旋酶/ATP酶結(jié)構(gòu)域以及特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),主要參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。CHD2屬于CHD亞家族Ⅰ,參與哺乳動物發(fā)育,腫瘤抑制,DNA損傷修復(fù)。相關(guān)研究表明CHD2與癲癇性腦病、生長遲緩、脊椎彎曲、智障相關(guān)。 在大腦皮層發(fā)育過程中,神經(jīng)前體細胞(neural progenitor cells, NPCs)分化產(chǎn)生各種類型的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞,從而形成神經(jīng)系統(tǒng)。盡管CHD2屬于ATP依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物,但其大腦皮層發(fā)育中的作用仍不清楚。我們首先發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的CHD2在神經(jīng)干細胞里特異性表達,因此CHD2可能參與調(diào)控神經(jīng)干細胞(NSCs)的自我更新。通過體外敲降實驗證實,敲降CHD2之后,促進所分離的原代神經(jīng)干細胞的神經(jīng)元分化同時抑制其自我更新。此外,我們首次采用胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù)(in utero electroporation)進行體內(nèi)研究CHD2在大腦皮層發(fā)育過程中的作用。在E13.5d的神經(jīng)前體細胞中特異性敲降和過表達CHD2,表明CHD2參與調(diào)控神經(jīng)前體細胞的增殖。在CHD2敲降后,位于VZ/SVZ (ventricular zone/subvertricular zone)的GFP標記細胞顯著減少。通過Brdu標記實驗進一步證實,CHD2促進VZ/SVZ的神經(jīng)前體細胞的S期細胞數(shù)目增加。CHD2敲降后VZ/SVZ的神經(jīng)前體細胞的S期細胞數(shù)目減少。過表達CHD2之后,位于VZ/SVZ區(qū)的GFP標記細胞顯著增加且VZ/SVZ的神經(jīng)前體細胞S期細胞數(shù)目增加。最后,我們通過ChIP實驗(chromatin immunoprecipitation)證實CHD2通過結(jié)合REST (RE1-silencing transcription factor)的啟動子直接調(diào)控REST的轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)控神經(jīng)前體細胞的增殖與分化。此外,CHD2結(jié)合啟動子區(qū)下游的CDS區(qū),可能通過其他機制來調(diào)控神經(jīng)前體細胞的多能性。
【關(guān)鍵詞】：ATP依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物 CHD2 神經(jīng)前體細胞 胚胎電轉(zhuǎn) ChIP REST
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R338
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 縮略詞表7-9
• 目錄9-11
• 第一章 前言11-19
• 1.1 ATP依賴的染色質(zhì)重塑體11
• 1.2 CHD家族結(jié)構(gòu)域11-17
• 1.2.1 CHD家族亞族分類及功能12-15
• 1.2.2 CHD2的功能15-16
• 1.2.3 神經(jīng)元產(chǎn)生機制16-17
• 1.3 研究目的意義17-19
• 第二章 材料方法19-35
• 2.1 材料19
• 2.1.1 細胞株19
• 2.1.2 實驗動物19
• 2.1.3 質(zhì)粒19
• 2.2 實驗試劑和儀器設(shè)備19-23
• 2.2.1 實驗試劑19
• 2.2.2 實驗試劑、培養(yǎng)基的配制19-20
• 2.2.3 其他常用試劑的配制20-21
• 2.2.4 主要抗體21
• 2.2.5 主要實驗儀器和材料21-23
• 2.3 實驗方法步驟23-35
• 2.3.1 質(zhì)粒提取23
• 2.3.2 大腸桿菌感受態(tài)的制備23-24
• 2.3.3 轉(zhuǎn)化24
• 2.3.4 293FT、N2A細胞復(fù)蘇24-25
• 2.3.5 293FT、N2A細胞凍存25
• 2.3.6 293FT或N2A細胞培養(yǎng)25
• 2.3.7 E12.5的胚胎大腦皮層NSC細胞分離與培養(yǎng)25
• 2.3.8 DNA瓊脂糖凝膠回收25-26
• 2.3.9 Trizol法提取鼠腦組織總mRNA26
• 2.3.10 CHD2基因目的片段的獲得26-27
• 2.3.11 菌落PCR反應(yīng)27-28
• 2.3.12 二步法RT-PCR操作28-29
• 2.3.13 載體雙酶切反應(yīng)29
• 2.3.14 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)29-30
• 2.3.15 細胞免疫組化染色(immunohistochemical staining)30
• 2.3.16 蛋白質(zhì)印跡實驗(western blot)30-31
• 2.3.17 胚胎腦組織固定、脫水31
• 2.3.18 冰凍切片31-32
• 2.3.19 胚胎電轉(zhuǎn)32
• 2.3.20 Brdu標記32
• 2.3.21 慢病毒的包裝32-33
• 2.3.22 病毒滴度的測定33
• 2.3.23 病毒感染細胞33
• 2.3.24 腦片Brdu染色33-34
• 2.3.25 shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建34-35
• 第三章 結(jié)果35-47
• 3.1 構(gòu)建CHD2敲降質(zhì)粒35-36
• 3.2 構(gòu)建CHD2過表達質(zhì)粒36-37
• 3.3 包裝病毒及病毒滴度的測定37-38
• 3.4 WESTERN BLOTTING檢測CHD2-SHRNA的敲降效率38-39
• 3.5 RT-PCR檢測CHD2過表達效率39-40
• 3.6 內(nèi)源性CHD2在神經(jīng)干細胞/前體細胞的表達40
• 3.7 體外敲降CHD2抑制神經(jīng)干細胞增殖并促進神經(jīng)元分化40-42
• 3.8 利用胚胎電轉(zhuǎn)技術(shù)研究CHD2在胚胎腦發(fā)育中的作用42
• 3.9 體內(nèi)敲降CHD2促進神經(jīng)元分化42-43
• 3.10 體內(nèi)敲降CHD2抑制神經(jīng)干細胞/前體細胞的增殖43-44
• 3.11 體內(nèi)過表達CHD2促進神經(jīng)前體細胞增殖44-45
• 3.12 CHD2結(jié)合REST啟動子區(qū)調(diào)控REST,促進神經(jīng)前體細胞增殖45-47
• 第四章 討論47-51
• 4.1 CHD2維持神經(jīng)前體細胞的自我更新47
• 4.2 CHD2結(jié)合到REST的啟動子上直接調(diào)控REST的轉(zhuǎn)錄47
• 4.3 尚需解決的問題47-51
• 第五章 結(jié)論51-53
• 參考文獻53-59
• 致謝59-61
• 碩士期間發(fā)表論文61

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 許榮初;熔天地之正氣 鑄自然之雄魂——談宋惠民的油畫藝術(shù)[J];美術(shù)大觀;2005年02期

2 錢人一;;寶馬新型雙渦輪增壓直噴式直列六缸汽油機(下)[J];汽車與配件;2008年27期

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本文編號：1011442