本文關(guān)鍵詞：共表達(dá)HIV-1 gag和gp145重組雞痘病毒疫苗的構(gòu)建、篩選及免疫原性研究

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【摘要】：目的：本課題研究的目的是以雞痘病毒為疫苗載體，以HIV-1衣殼蛋白(gag)和糖蛋白(gp145)為免疫原構(gòu)建HIV重組雞痘病毒疫苗，以BALB/c小鼠為模型動(dòng)物檢測其免疫原性，同時(shí)開展安全性初步研究，以期篩選出一株安全有效的適用于中國人群的艾滋病治療性疫苗。 方法：以目的基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，PCR技術(shù)擴(kuò)增HIV-1gag和gp145基因，進(jìn)行DNA測序；然后將測序正確的兩個(gè)目的基因分別插入到雞痘病毒穿梭載體pTKET-EGFP的不同的表達(dá)框內(nèi)，構(gòu)建攜帶gag和gp145基因的重組質(zhì)粒pTKET-EGFP-HIV gag-HIVgp145簡稱pTKET-EGFP-Hg-Hp，與雞痘病毒FPV282E4共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，構(gòu)建重組雞痘病毒，以EGFP為篩選標(biāo)記，篩選獲得表達(dá)HIV-1gag、gp145和EGFP的重組雞痘病毒，繼而利用Cre/Loxp系統(tǒng)將報(bào)告基因敲除，獲得不含報(bào)告基因的重組雞痘病毒rFPVHg-Hp，通過RT-PCR和Western blot方法檢測目的基因的表達(dá)，并分析外源基因及重組雞痘病毒的遺傳穩(wěn)定性。在以上研究的基礎(chǔ)上，，免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠，檢測其血清中HIV特異性抗體水平和GAG-specific T cells的細(xì)胞水平以及病毒的殘留，分析重組雞痘病毒rFPVHg-Hp的免疫原性和安全性。 結(jié)果：經(jīng)PCR擴(kuò)增和基因測序驗(yàn)證，成功獲得HIV-1gag和HIV gp145基因，然后應(yīng)用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建重組雞痘病毒穿梭質(zhì)粒pTKET-EGFP-Hg-Hp。利用同源重組技術(shù)，通過10次噬斑篩選，PCR檢測表明目的基因已整合到重組雞痘病毒基因組中，RT-PCR、Western blot結(jié)果表明HIV-1gag和HIV gp145在感染細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)且具有抗原性。連續(xù)傳代20次，PCR、RT-PCR、Western blot均能檢測到外源基因的整合、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，且未能擴(kuò)增出FPV-TK基因，表明重組病毒遺傳穩(wěn)定性良好，而且病毒已經(jīng)純化。由ELISPOT及HIV特異性抗體IgG水平和雞痘病毒殘留檢測結(jié)果初步表明，重組雞痘病毒疫苗rFPVHg-Hp具有良好的免疫原性和安全性。 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組雞痘病毒疫苗rFPVHg-Hp，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了其具備良好的免疫性和安全性，為臨床前研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：重組雞痘病毒 HIV-1gag-gp145 IFN-γ IgG
【學(xué)位授予單位】：長春中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要5-6
• ABSTRACT6-8
• 英文縮略語8-10
• 前言10-13
• 文獻(xiàn)綜述13-21
• 1 HIV 疫苗的研究進(jìn)展13-20
• 1.1 以誘導(dǎo)廣譜中和單克隆抗體為核心的疫苗14-17
• 1.2 以誘導(dǎo) CTL 反應(yīng)為核心的疫苗17-19
• 1.3 HIV 疫苗研發(fā)的主要障礙和挑戰(zhàn)19
• 1.4 相關(guān)措施19-20
• 2 總結(jié)與展望20-21
• 第一章 目的基因克隆和重組雞痘病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建21-30
• 1 材料與方法21-24
• 2 結(jié)果24-29
• 3 小結(jié)29-30
• 第二章 表達(dá) HIV-1 主要結(jié)構(gòu)蛋白重組雞痘病毒的篩選與鑒定30-43
• 1 材料與方法30-36
• 2 結(jié)果36-42
• 3 小結(jié)42-43
• 第三章 HIV-1 重組雞痘病毒候選疫苗的免疫原性研究43-51
• 1 材料與方法43-47
• 2 結(jié)果47-50
• 3 小結(jié)50-51
• 討論51-54
• 1 目的基因克隆和重組雞痘病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建51
• 2 表達(dá) HIV-1 主要結(jié)構(gòu)蛋白重組雞痘病毒的篩選與鑒定51-52
• 3 HIV-1 重組雞痘病毒候選疫苗的免疫原性研究52-54
• 結(jié)語54-55
• 致謝55-56
• 參考文獻(xiàn)56-66

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馮霞;余雙慶;劉紅梅;劉新蕾;王小利;周玲;曾毅;;HIV-1 B亞型gag基因密碼子優(yōu)化及其免疫原性的研究[J];病毒學(xué)報(bào);2008年03期

本文編號：1008594