本文關(guān)鍵詞：綠膿桿菌鞭毛蛋白FlgE的重組表達(dá)及初步活性鑒定

  更多相關(guān)文章： 綠膿桿菌 鞭毛蛋白 FlgE 原核表達(dá)載體 角膜上皮細(xì)胞 炎性因子

【摘要】：目的：原核表達(dá)及純化綠膿桿菌鞭毛蛋白FlgE并進(jìn)行初步活性鑒定。 方法：分析綠膿桿菌鞭毛蛋白FlgE的基因序列，設(shè)計(jì)帶適當(dāng)酶切位點(diǎn)的引物，用PCR方法擴(kuò)增出FlgE的編碼DNA序列，與大腸桿菌表達(dá)載體pET24a同時(shí)經(jīng)NdeI/HindIII雙酶切、純化及連接后構(gòu)建pET24a-FlgE原核表達(dá)質(zhì)粒，，挑選重組陽性質(zhì)粒經(jīng)DNA測序確認(rèn)序列正確，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化，使重組質(zhì)粒表達(dá)目的蛋白,采用組氨酸標(biāo)簽親和層析等法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，通過SDS-PAGE對(duì)純化后蛋白分子量進(jìn)行鑒定，用試劑盒進(jìn)行去內(nèi)毒素化處理。在體外培養(yǎng)人角膜上皮細(xì)胞系細(xì)胞，加入純化的FlgE重組蛋白，培養(yǎng)4小時(shí)后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測各種相關(guān)的炎性因子以反映FlgE蛋白活性。 結(jié)果：可用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的重組pET24a-FlgE構(gòu)建成功,其編碼的蛋白在BL21中獲得高效表達(dá)，當(dāng)誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷濃度為1mmol/L，在16℃、225r/m振蕩培養(yǎng)20小時(shí)時(shí)，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)量最高，經(jīng)純化、去內(nèi)毒素處理和SDS-PAGE分子量鑒定，獲得純化的重組FlgE蛋白。角膜上皮細(xì)胞用20μg/mL FlgE處理后，細(xì)胞內(nèi)炎性相關(guān)分子IL-6和IL-8的表達(dá)量明顯上升，而滅活的FlgE蛋白則喪失該刺激活性。 結(jié)論：獲得純化的重組綠膿桿菌鞭毛蛋白FlgE，且可刺激角膜上皮細(xì)胞上調(diào)炎性因子IL-6、IL-8的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：綠膿桿菌 鞭毛蛋白 FlgE 原核表達(dá)載體 角膜上皮細(xì)胞 炎性因子
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.991
【目錄】：

• 研究生導(dǎo)師介紹5-7
• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 主要符號(hào)表10-11
• 引言11-13
• 第一章 材料和方法13-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料13-18
• 1.2 方法18-27
• 第二章 結(jié)果27-30
• 2.1 FlgE 基因的擴(kuò)增以及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建27
• 2.2 重組 FlgE 的表達(dá)及純化27-29
• 2.3 重組 FlgE 促進(jìn) HCEC 分泌炎性因子29-30
• 第三章 討論30-32
• 參考文獻(xiàn)32-34
• 綜述34-45
• 參考文獻(xiàn)40-45
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果45-46
• 致謝46

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 黃陸穎;巫艷彬;王武;秦志強(qiáng);韋彩周;;Toll樣受體-2與腺苷脫氨酶測定對(duì)結(jié)核性胸水的診斷意義[J];廣西醫(yī)學(xué);2013年09期

2 鄒芝英;王倩;楊弘;李大宇;祝t熈

本文編號(hào)：1003795