本文關鍵詞：微鈣化動脈粥樣硬化斑塊兔模型建立與染色方法的比較

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【摘要】：研究背景 盡管目前冠心病的診療措施取得較大的進展,冠心病仍然是世界范圍內(nèi)發(fā)病和死亡的主要原因之一。2010年我國有近360萬人死于心血管疾病,平均每天逾9,800人死于心血管病。急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)為冠心病急癥,其包括不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死、心性猝死等一系列臨床病理生理狀態(tài)。易損斑塊破裂、繼發(fā)血栓形成,使血流急劇減少或者完全阻斷,是ACS的主要病理生理基礎。一般認為易損斑塊的形態(tài)學特征包括：薄纖維帽(65μ m)、大脂質(zhì)核心、大量激活巨噬細胞及炎癥浸潤。目前認為導致易損斑塊破裂的原因有脂質(zhì)核心的擴大、斑塊內(nèi)炎癥、細胞外基質(zhì)合成減少及降解增加,局部應力增加等。雖然關于易損斑塊破裂的機制研究取得重大進展,但易損斑塊破裂的機制尚不完全清楚,仍存在一些矛盾的地方,需進一步識別影響斑塊穩(wěn)定性的其他因素,促使其向穩(wěn)定方向轉(zhuǎn)化,對于預防急性心血管事件的發(fā)生具有重要意義,也是臨床上目前需要急待解決的關鍵問題。 鈣化是動脈粥樣硬化的一個顯著特征。與之前的體積較大的鈣化不同,近期利用高分辨率的激光共聚焦顯微鏡和micro-ct發(fā)現(xiàn)一種直徑在微米水平的點狀鈣化,稱為微鈣化。微鈣化在斑塊內(nèi)分布廣泛,纖維帽、脂質(zhì)核心中均可發(fā)現(xiàn)微鈣化。微鈣化對斑塊穩(wěn)定性的影響愈發(fā)受到關注。Vengrenyuk等首次利用Goodier數(shù)學模型證實薄纖維帽處(65μm)的微鈣化可使其周圍的應力加倍,引起界面分離,導致斑塊破裂。隨后學者又利用數(shù)學模型證實微鈣化的空間位置及形態(tài)影響其對斑塊穩(wěn)定性的作用。狹長形微鈣化比球形微鈣化增加的應力更多。微鈣化能解釋某些目前解釋不清的斑塊破裂,成為新的重要的影響斑塊穩(wěn)定性的因素。但目前仍存在一些問題,對微鈣化的研究都是基于三維模擬及數(shù)學模型分析,它的準確性尚需進行體內(nèi)實驗驗證。相關的微鈣化動物模型缺乏,限制微鈣化的體內(nèi)研究。因此建立微鈣化動脈粥樣硬化斑塊動物模型及可識別微鈣化的病理學染色方法成為體內(nèi)驗證、進一步研究微鈣化的關鍵。 動脈粥樣硬化的發(fā)生與局部的血流動力學因素密切相關。血流與內(nèi)皮細胞表面摩擦產(chǎn)生的剪切力在內(nèi)皮細胞功能障礙及動脈粥樣硬化進程中作用重大。低剪切力和振蕩剪切力是造成動脈粥樣硬化病變非隨機灶性分布的主要因素。內(nèi)皮細胞膜表面的力學敏感受體識別剪切力信號并將其轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)的生化信號,引起內(nèi)皮細胞結構和功能的改變。低剪切力、振蕩剪切力作用下,內(nèi)皮細胞高表達細胞粘附分子、活性氧產(chǎn)生增多,促進單核細胞粘附、低密度脂蛋白氧化修飾,加速動脈粥樣硬化發(fā)生。血流剪切力的變化不僅參與動脈粥樣硬化的發(fā)生,且與斑塊內(nèi)鈣化密切相關。Stefan等通過血管內(nèi)超聲及虛擬組織顯像技術分析冠狀動脈分支處斑塊負荷及組織成份,發(fā)現(xiàn)在分支的對側壁,即一般認為的低剪切力區(qū),斑塊負荷大且鈣化嚴重。利用符合流體力學原理的套管可實現(xiàn)同時模擬不同形式的剪切力。 目前兔腹主動脈內(nèi)皮球囊機械性損傷加高脂飼料喂養(yǎng)是復制動脈粥樣硬化的傳統(tǒng)模型。在該模型中,可見斑塊內(nèi)富含脂質(zhì)、膠原,炎性細胞浸潤亦可在該類動物模型中得以復制,但鈣化發(fā)生較少。為建立合適的微鈣化動脈粥樣硬化兔模型,需對傳統(tǒng)模型加以改進。鑒于血流剪切力對動脈粥樣硬化及鈣化的影響,本實驗意在傳統(tǒng)模型的基礎上引入腹主動脈套管縮窄術,模擬不同形式的剪切力,在內(nèi)皮損傷炎癥、高脂環(huán)境、血流剪切力三重因素作用下,以期建立微鈣化動脈粥樣硬化斑塊模型,使微鈣化的體內(nèi)驗證成為可能。 茜素紅S (Alizarin red s)和馮·科薩(Von kossa)染色是組織學上常用的鈣質(zhì)染色技術。二者的原理不同,馮·科薩染色利用硝酸銀溶液與鈣鹽的磷酸根或碳酸根反應生成相應的磷酸銀或碳酸銀,后者可被日光或者紫外線還原為黑灰或黑色的金屬銀；茜素紅S通過結構中的硫酸基團及羥基基團與鈣離子反應形成粉紅色或紅色鈣鹽。茜素紅S染料具有熒光活性,染色結果可利用分辨率高的激光共聚焦顯微鏡觀察。利用本實驗建立的微鈣化動脈粥樣硬化斑塊模型對比茜素紅S和馮·科薩這兩種常用的鈣質(zhì)染色技術用于微鈣化染色的可行性和異同點,為日后進一步研究微鈣化提供技術支持。 研究內(nèi)容 (1)建立微鈣化動脈粥樣硬化斑塊兔模型 (2)比較茜素紅s和馮·科薩染色用于微鈣化染色的可行性和異同點 研究方法 30只雄性新西蘭兔,在高脂飼料喂養(yǎng)和腹主動脈內(nèi)皮球囊損傷基礎上,隨機分為套管組(給予腹主動脈雙楔形套管縮窄)和非套管組,每組各15只,喂養(yǎng)12周。應用體表超聲檢查兩組術前及術后12周腹主動脈的平均血流速度、舒張末期內(nèi)徑,同時檢測血液粘滯度,計算術前及術后12周的血流剪切力。安樂死動物后,取兩組相對應的腹主動脈為組織標本,制成石蠟、冰凍切片。通過常規(guī)的病理學染色及免疫組織化學測定斑塊內(nèi)脂質(zhì)、膠原、平滑肌細胞、巨噬細胞的含量。對連續(xù)的石蠟切片分別進行茜素紅S和馮·科薩染色,染色結果在普通光學顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡下觀察。 研究結果 (1)套管組和非套管組均形成動脈粥樣硬化斑塊。 (2)套管組微鈣化發(fā)生率和鈣化面積高于非套管組(P0.05)。 (3)茜素紅s和馮·科薩染色識別微鈣化的敏感性相同,前者具有熒光活性的優(yōu)勢,但對于微鈣化的定位準確性遜于后者。 結論 (1)在腹主動脈內(nèi)皮球囊損傷加高脂飼料喂養(yǎng)的傳統(tǒng)模型基礎上引入腹主動脈套管縮窄,成功建立了微鈣化動脈粥樣硬化斑塊兔模型。 (2)茜素紅s和馮·科薩染色均能較好的識別微鈣化。
【關鍵詞】：微鈣化 動脈粥樣硬化 茜素紅S染色 馮·科薩染色 動物模型
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R543.5;R-332
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-14
• 前言14-16
• 1 資料與方法16-24
• 2 結果24-26
• 3 討論26-32
• 4 結論32-33
• 5 附表附圖33-40
• 參考文獻40-43
• 綜述43-53
• 參考文獻49-53
• 致謝53-54
• 讀研期間發(fā)表的論文54-55
• 學位論文評閱及答辯情況表55

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：1003283