本文關(guān)鍵詞：miR-3473b在局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：目的:研究mi RNA-3473b在腦缺血再灌注損傷中的表達(dá)和功能并初步探究潛在的調(diào)控機(jī)制。方法:體外模型我們利用脂多糖(LPS)和原代皮層神經(jīng)元缺糖缺氧(OGD)再灌注后的條件上清刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),采用q RT-PCR法檢測mi R-3473b的表達(dá)變化;然后將mi R-3473b antagomir轉(zhuǎn)染至BV2細(xì)胞,抑制mi R-3473b后,分別用LPS和原代皮層神經(jīng)元OGD的上清刺激BV2細(xì)胞,分別采用q RT-PCR和Western blot法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起炎癥因子表達(dá)的變化。為了研究mi RNA-3473b發(fā)揮作用的靶點(diǎn),我們將mi RNA-3473b mimic轉(zhuǎn)染至BV2細(xì)胞中過表達(dá)mi RNA-3473b,采用q RT-PCR和Western blot法檢測SOCS3的表達(dá)水平;隨后,構(gòu)建包含作用位點(diǎn)的野生型和突變型SOCS3 m RNA 3’UTR luciferase報告系統(tǒng),采用熒光素酶報告基因的方法驗(yàn)證mi R-3473b的靶點(diǎn)。體內(nèi)模型我們使用線栓法建立小鼠局灶性大腦中動脈阻塞(transient middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,采用q RT-PCR法檢測腦缺血后小鼠白細(xì)胞、皮層和紋狀體缺血半暗帶中mi RNA-3473b的表達(dá)變化。采用側(cè)腦室立體定位注射mi R-3473b antagomir抑制mi R-3473b的作用,3天后構(gòu)建小鼠MCAO模型。我們以2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)染色測定腦梗死體積,并取相關(guān)組織以q RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測小膠質(zhì)細(xì)胞激活而引起的炎癥介質(zhì)的基因和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,BV2小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS和原代皮層神經(jīng)元OGD上清的分別刺激后,mi R-3473b的表達(dá)顯著上升;以mi R-3473b antagomir抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞mi R-3473b表達(dá)水平,可降低LPS或原代神經(jīng)元OGD上清刺激激活BV2所引起的i NOS、COX-2、TNF-α和IL-6炎癥因子的m RNA及蛋白水平的上升。BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)mi R-3473b后,SOCS3的m RNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低;Luciferase assay顯示,在HEK293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染野生型SOCS3和mi R-3473b mimic比共轉(zhuǎn)染種子序列突變型SOCS3和mi R-3473b mimic的熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯降低。另外,在體內(nèi)試驗(yàn)中,與假手術(shù)組相比,小鼠MCAO再灌注后白細(xì)胞、皮層和紋狀體缺血半暗帶中mi R-3473b表達(dá)均顯著上升;TTC染色結(jié)果表明側(cè)腦室立體定位注射mi R-3473b antagomir的小鼠比注射NC antagomir小鼠腦梗死體積明顯減小;同時,mi R-3473b antagomir組降低皮層缺血半暗帶中炎癥因子i NOS、COX-2、TNF-α和IL-6的m RNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)論:腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)mi R-3473b水平升高,mi R-3473b的誘導(dǎo)表達(dá)加劇腦缺血再灌注損傷,其作用機(jī)制可能是與通過靶向SOCS3介導(dǎo)炎癥反應(yīng)相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：miR-3473b 腦缺血 BV2 炎癥 SOCS3
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-13
• 第一章 體外實(shí)驗(yàn)13-26
• 一、實(shí)驗(yàn)材料13-15
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器13
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑13-15
• 二、實(shí)驗(yàn)方法15-21
• 2.1 溶液配制15-16
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)16
• 2.3 原代神經(jīng)元OGD上清的收集16
• 2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染16-17
• 2.5 實(shí)時定量PCR17-19
• 2.6 Western Blot19-20
• 2.7 雙熒光素酶報告基因的檢測20-21
• 2.8 ELISA21
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-26
• 1. LPS和神經(jīng)元條件培養(yǎng)基刺激BV2細(xì)胞后miR-3473b表達(dá)上升21-22
• 2. 抑制miR-3473b表達(dá)下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子的表達(dá)22-23
• 3. 抑制miR-3473b表達(dá)下調(diào)神經(jīng)元條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子的表達(dá)23-24
• 4. miR-3473b下調(diào)BV2細(xì)胞中SOCS3的表達(dá)24
• 5. 雙熒光素酶報告基因驗(yàn)證靶基因24-26
• 第二章 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)26-36
• 一、實(shí)驗(yàn)材料26-28
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物26
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器26-27
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑27-28
• 二、實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 2.1 小鼠MCAO模型28
• 2.2 TTC染色28
• 2.3 實(shí)時定量PCR28-29
• 2.4 Western Blot29-30
• 2.5 ELISA30
• 2.6 統(tǒng)計(jì)分析30-31
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-36
• 1. MCAO小鼠白細(xì)胞中mi R-3473b表達(dá)上調(diào)31
• 2. miR-3473b在MCAO小鼠缺血半暗帶組織中表達(dá)上調(diào)31-32
• 3. 抑制miR-3473b表達(dá)對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用32-33
• 4. miR-3473b antagomir顯著降低皮層半暗帶炎癥因子mRNA表達(dá)33-34
• 5. miR-3473b antagomir顯著降低皮層半暗帶炎癥因子蛋白的表達(dá)34-36
• 討論36-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 綜述44-52
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 已發(fā)表文章52-53
• 英文縮寫詞表53-54
• 致謝54-55

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1 王小玉;miR-3473b在局灶性腦缺血再灌注損傷中的作用及其機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2016年

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本文編號：848535