研究背景:膠質(zhì)母細胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的致死性原發(fā)惡性腦腫瘤,約占成人腦腫瘤的60%以上。盡管針對多形性膠質(zhì)母細胞瘤患者已經(jīng)采用了最新的綜合治療方案,即最大范圍安全切除腫瘤,放射治療、同步和或輔助化學治療、靶向治療等,但患者的中位生存期仍然只有8-15個月。高度侵襲性是膠質(zhì)母細胞瘤一個顯著的生物學特點,是導致腫瘤快速進展和患者預后不良的重要因素。侵襲性生長導致外科手術(shù)不能徹底切除膠質(zhì)母細胞瘤,而殘留的腫瘤細胞和腫瘤組織成為術(shù)后快速復發(fā)和患者高致死率的根源,由此可見,單純使用外科手術(shù)是無法治愈膠質(zhì)母細胞瘤的。膠質(zhì)母細胞瘤高度侵襲性除了依賴腫瘤細胞具有較強的遷移能力和侵襲能力外,腫瘤細胞對細胞外基質(zhì)的降解和重塑也是重要因素之一。通常,腫瘤細胞通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶和尿激酶纖溶酶原激活物等因子來降解細胞外基質(zhì),繼而為腫瘤細胞遷移和侵襲開辟前進的道路。除此之外,腫瘤細胞通過自分泌和旁分泌方式釋放多種細胞因子和炎癥因子來改變腫瘤微環(huán)境,為腫瘤遷移和侵襲創(chuàng)造有利條件。既往研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)降壓素受體1通過激活Rho家族鳥苷三磷酸酶、粘著斑激酶、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶等多種信號通路來促進基因轉(zhuǎn)錄和腫瘤生長。作者在前期研究中發(fā)現(xiàn),在膠質(zhì)瘤組織中神經(jīng)降壓素受體1呈顯著高表達狀態(tài),表達水平與腫瘤的病理級別呈正相關(guān)性,與患者的預后呈負相關(guān)性。在膠質(zhì)瘤中,活化的神經(jīng)降壓素受體1參與了細胞增殖、細胞凋亡和腫瘤干細胞“干性”維持等多種生物學進程,而使用神經(jīng)降壓素受體1的特異性拮抗劑SR48692或者敲低神經(jīng)降壓素受體1均可抑制上述生物學效果。值得注意的是,作者在前期研究中還觀察到,神經(jīng)降壓素受體1似乎可以通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路來促進膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲,而敲低神經(jīng)降壓素受體1或使用受體拮抗劑均可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲,但具體分子機制需要進一步探究。微小RNA是一類短鏈非編碼RNA,微小RNA與相應(yīng)蛋白形成RNA誘導的沉默復合物RISC,而RISC通過與目標基因mRNA的3端非轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)合來抑制mRNA的翻譯或者降解該mRNA,并最終抑制目標基因的表達。越來越多的研究證實,微小RNA在腫瘤的進展過程中發(fā)揮了重要作用,并可以根據(jù)微小RNA的功能將其劃分為致癌型微小RNA和抑癌型微小RNA。前期研究證實,微小RNA在膠質(zhì)瘤組織中異常表達,并參與了腫瘤細胞的增殖過程。但微小RNA與膠質(zhì)母細胞瘤遷移和侵襲之間的關(guān)系還需要進一步研究。研究目的:1.觀察神經(jīng)降壓素受體1對膠質(zhì)母細胞瘤遷移和侵襲的影響。2.闡明神經(jīng)降壓素受體1誘導膠質(zhì)母細胞瘤遷移和侵襲的分子機制。材料方法:使用小RNA干擾技術(shù)敲低NTSR1、Jun、SOCS6蛋白的表達。使用Jun過表達載體上調(diào)Jun蛋白的表達。免疫印跡實驗檢測NTSR1、Jun、SOCS6蛋白的表達水平。CCK-8實驗檢測U87MG和U118MG細胞的增殖活性。細胞劃痕實驗檢測U87MG和U118MG細胞的遷移能力。Transwell侵襲實驗檢測U87MG和U118MG細胞的侵襲能力。ChIP實驗檢測轉(zhuǎn)錄因子Jun與miR-494啟動子區(qū)域的結(jié)合情況。使用shNTSR1-U87MG和shNTSR1+miR-494-U87MG細胞構(gòu)建裸鼠原位移植瘤模型。MRI檢測原位移植瘤的生長情況。HE染色觀察移植瘤模型的侵襲情況。Kaplan-Meier生存曲線檢測荷瘤裸鼠的生存時間。研究結(jié)果:1.神經(jīng)降壓素受體1促進膠質(zhì)母細胞瘤的遷移和侵襲 敲低神經(jīng)降壓素受體1不影響膠質(zhì)母細胞瘤24小時內(nèi)的增殖活性。敲低神經(jīng)降壓素受體1顯著抑制U87MG和U118MG細胞的遷移能力和侵襲能力。敲低神經(jīng)降壓素受體1可明顯抑制原位移植瘤的生長和侵襲。敲低神經(jīng)降壓素受體1可顯著延長荷瘤裸鼠的生存時間。2.神經(jīng)降壓素受體1調(diào)控Jun/miR-494/SOCS6信號通路 敲低神經(jīng)降壓素受體1抑制U87MG和U118MG細胞中miR-494和轉(zhuǎn)錄因子Jun的表達。ChIP實驗顯示,在U87MG細胞中轉(zhuǎn)錄因子Jun可以與miR-494啟動子區(qū)域結(jié)合。在U87MG和U118MG細胞中敲低Jun可抑制miR-494的表達,而過表達Jun可促進miR-494的表達。微小RNA靶點預測數(shù)據(jù)庫提示SOCS6是miR-494潛在的作用靶點。熒光素酶報告基因提示,miR-494可以與SOCS6的3端非轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)合。敲低神經(jīng)降壓素受體1可上調(diào)SOCS6蛋白的表達,而過表達miR-494可抑制SOCS6蛋白的表達。拮抗miR-494可以恢復SOCS6蛋白的表達。敲低神經(jīng)降壓素受體1可上調(diào)原位移植瘤中SOCS6蛋白的表達。過表達miR-494可抑制原位移植瘤中SOCS6蛋白的表達。3.神經(jīng)降壓素受體1通過miR-494/SOCS6通路促進膠質(zhì)母細胞瘤侵襲 上調(diào)miR-494可促進U87MG和U118MG細胞的遷移能力和侵襲能力,而拮抗miR-494可以抑制U87MG和U118MG細胞的遷移能力和侵襲能力。敲低SOCS6可促進U87MG和U118MG細胞的遷移能力和侵襲能力。過表達miR-494可促進原位移植瘤的生長和侵襲,過表達miR-494也可以顯著地減短荷瘤裸鼠的生存時間。研究結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)敲低神經(jīng)降壓素受體1抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的遷移能力和侵襲能力。神經(jīng)降壓素受體1具有調(diào)控Jun/miR-494/SOCS6信號通路的作用,該信號通路在神經(jīng)降壓素受體1誘導的膠質(zhì)母細胞瘤遷移和侵襲過程中發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果有利于為探尋抗膠質(zhì)母細胞瘤侵襲的治療靶點提供初步實驗依據(jù)。
【學位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

siNTSR1 可以顯著地敲低 U87MG 細胞系中神經(jīng)降壓素受 1 蛋白的siNTSR1 可以顯著地敲低 U118MG 細胞系中神經(jīng)降壓素受體 1 蛋白低神經(jīng)降壓素受體 1 抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞系的遷移能力細胞瘤細胞系 U87MG 和 U118MG 細胞中轉(zhuǎn)染 siNTSR1，母細胞瘤細胞系的遷移能力。發(fā)現(xiàn)敲低神經(jīng)降壓素受體 1 系的遷移能力（圖 2）。

siNTSR1 可以顯著地敲低 U118MG 細胞系中神經(jīng)降壓素受體 1 蛋白低神經(jīng)降壓素受體 1 抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞系的遷移能力母細胞瘤細胞系 U87MG 和 U118MG 細胞中轉(zhuǎn)染 siNTSR1，采質(zhì)母細胞瘤細胞系的遷移能力。發(fā)現(xiàn)敲低神經(jīng)降壓素受體 1 可胞系的遷移能力（圖 2）。

-2 siNTSR1 可以顯著地敲低 U118MG 細胞系中神經(jīng)降壓素受體 1 蛋白的表 敲低神經(jīng)降壓素受體 1 抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞系的遷移能力質(zhì)母細胞瘤細胞系 U87MG 和 U118MG 細胞中轉(zhuǎn)染 siNTSR1，采膠質(zhì)母細胞瘤細胞系的遷移能力。發(fā)現(xiàn)敲低神經(jīng)降壓素受體 1 可以細胞系的遷移能力（圖 2）。
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