本文關(guān)鍵詞：PEI-PEG-Angiopep介導(dǎo)胸苷激酶靶向腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 神經(jīng)膠質(zhì)瘤 胸苷激酶 PEI-PEG-Angiopep 膠質(zhì)原位瘤

【摘要】：基因治療是治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤有效方法之一,胸苷激酶(thymidine kinase,TK)能夠?qū)o毒的前體藥物更昔洛韋(ganciclovir,GCV)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)更昔洛韋三磷酸(ganciclovir triphosphate,GCV-TP),從而干擾DNA合成,使DNA復(fù)制終止細(xì)胞死亡。除此之外,GCV/TK還呈現(xiàn)旁觀者效應(yīng)。目前主要以病毒載體和干細(xì)胞介導(dǎo)TK表達(dá),但病毒載體存在安全隱患,干細(xì)胞有其應(yīng)用的局限性。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)為非病毒類基因載體,具有優(yōu)越的基因傳遞性能,常被用于基因轉(zhuǎn)染,通過在PEI表面引入靶向基團(tuán)可以實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向。本研究首先通過慢病毒介導(dǎo)TK表達(dá),發(fā)現(xiàn)GCV/TK能夠有效抑制HEK293T和膠質(zhì)瘤SHG44的增殖,呈現(xiàn)出GCV濃度依賴和時(shí)間依賴效應(yīng)。比較細(xì)胞增殖抑制率發(fā)現(xiàn),表達(dá)TK的HEK293T和SHG44細(xì)胞,GCV的IC50分別為53.0μM,和15.49μM,表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)GCV/TK具有更好的敏感性。進(jìn)一步,將表達(dá)TK與未表達(dá)TK的SHG44細(xì)胞按1:1的比例混合培養(yǎng),GCV處理后,未表達(dá)TK的SHG44也死亡,表明GCV/TK在膠質(zhì)瘤中有旁觀者效應(yīng)。進(jìn)一步,體內(nèi)荷瘤研究表明,GCV/TK能抑制腫瘤的增殖。為了避免病毒載體可能出現(xiàn)的安全隱患,引用了非病毒類基因載體PEI-PEG。結(jié)果表明,PEI-PEG能介導(dǎo)TK在U87MG中表達(dá),有效表達(dá)的TK使GCV轉(zhuǎn)化為GCV-TP,產(chǎn)生細(xì)胞毒性,抑制細(xì)胞增殖。為了能夠更好的實(shí)現(xiàn)腦靶向,在PEI-PEG上鍵合腦靶向基團(tuán)Angiopep、引入膠質(zhì)細(xì)胞特異啟動(dòng)子GFAP,這些策略都有效介導(dǎo)TK的表達(dá)使GCV轉(zhuǎn)化為GCV-TP,從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖,這些工作表明PEI-PEG不僅具有良好的基因傳輸性能,還可以實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)。目前,我們建立了U87MG-Luc腦膠質(zhì)原位瘤模型,為更好的研究PEI-PEG-Angiopep介導(dǎo)TK實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá),使GCV轉(zhuǎn)化為GCV-TP抑制膠質(zhì)原位瘤提供了平臺(tái)。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)膠質(zhì)瘤 胸苷激酶 PEI-PEG-Angiopep 膠質(zhì)原位瘤
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.4
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 1 引言7-14
• 1.1 膠質(zhì)瘤基因治療的現(xiàn)狀7-8
• 1.2 TK對(duì)膠質(zhì)瘤治療的現(xiàn)狀8-10
• 1.3 血腦屏障是基因治療的一個(gè)難點(diǎn)10-11
• 1.4 納米材料作為基因載體的優(yōu)勢(shì)11-12
• 1.5 腦膠質(zhì)原位瘤動(dòng)物模型12
• 1.6 本文研究的目的和意義12-14
• 2 材料和方法14-20
• 2.1 細(xì)胞系、菌種、質(zhì)粒、納米載體14
• 2.2 主要試劑和抗體14
• 2.3 主要儀器14
• 2.4 細(xì)胞培養(yǎng)14-15
• 2.5 構(gòu)建p3xflag-cmv10TK表達(dá)載體15-16
• 2.5.1 引物序列設(shè)計(jì)15
• 2.5.2 PCR的反應(yīng)條件15
• 2.5.3 構(gòu)建p3xflag-cmv10TK克隆15-16
• 2.6 質(zhì)粒的大量制備16
• 2.7 慢病毒包裝和侵染16-17
• 2.7.1 慢病毒的包裝16-17
• 2.7.2 慢病毒的侵染17
• 2.8 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染17
• 2.9 Western Blot17-18
• 2.9.1 蛋白裂解液的制備17
• 2.9.2 細(xì)胞蛋白的提取17
• 2.9.3 免疫印跡17-18
• 2.10 體外血腦屏障模型的構(gòu)建18
• 2.10.1 體外血腦屏障的構(gòu)建18
• 2.10.2 體外血腦屏障模型的驗(yàn)證18
• 2.11 MTT實(shí)驗(yàn)18
• 2.12 建立腦膠質(zhì)原位瘤動(dòng)物模型18-19
• 2.12.1 U87MG-Luc細(xì)胞的構(gòu)建18
• 2.12.2 U87MG-Luc裸鼠皮下模型18-19
• 2.12.3 U87MG-Luc裸鼠腦原位瘤模型19
• 2.13 免疫組化染色19-20
• 3 結(jié)果與分析20-28
• 3.1 TK慢病毒的包裝、侵染以及表達(dá)20
• 3.2 GCV/TK抑制HEK293T細(xì)胞的增殖20-21
• 3.3 膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)GCV/TK呈現(xiàn)更好的敏感性21-22
• 3.4 GCV/TK在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在旁觀者效應(yīng)22-23
• 3.5 慢病毒介導(dǎo)TK在膠質(zhì)瘤內(nèi)表達(dá)23
• 3.6 PEI-PEG介導(dǎo)TK有效的表達(dá)，結(jié)合GCV能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖23-24
• 3.7 體外血腦屏障模型的構(gòu)建24-25
• 3.8 PEI-PEG-Angiopep介導(dǎo)TK在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)25-26
• 3.9 GFAP特異性啟動(dòng)子介導(dǎo)TK組織特異性表達(dá)26-27
• 3.10 腦膠質(zhì)原位瘤動(dòng)物模型的構(gòu)建27-28
• 4 討論28-30
• 5 結(jié)論30-31
• 參考文獻(xiàn)31-37
• 致謝37

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 廖新波,孫寧,陳小毅,熊暉;Epstein-Barr病毒胸苷激酶在大腸桿菌表達(dá)的研究[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2001年03期

2 李小騰;王鋒;黃平;;直腸癌患者血清胸苷激酶檢測(cè)的臨床意義[J];江蘇醫(yī)藥;2009年12期

3 周源;汪棟;楊愛珍;Ellen He;Sven Skog;張e，

本文編號(hào)：848261