本文關(guān)鍵詞：1,25-雙羥維生素D3對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠自噬的調(diào)控作用

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【摘要】：目的:多發(fā)性硬化不僅是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病,也是一種神經(jīng)變性疾病,其發(fā)病率和地理緯度具有明顯相關(guān)性,越遠(yuǎn)離赤道,多發(fā)性硬化的發(fā)病率越高。本實(shí)驗(yàn)選用1,25(OH)2D3作為干預(yù)藥物,研究其治療多發(fā)性硬化的有效性,不僅研究其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)髓鞘的影響,還深入研究對灰質(zhì)神經(jīng)元的作用,并進(jìn)一步探索其潛在的作用機(jī)制。方法:將27只周齡在8-10周左右,體重在18-20g左右的C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為正常對照組,EAE組,VD3組(即1,25(OH)2D3給藥組),各組均為9只。以MOG多肽為抗原免疫后兩組小鼠建立EAE動(dòng)物模型。以250μg人工合成MOG35-55多肽溶到500μl生理鹽水中,和等體積含1mg/ml結(jié)核菌素的完全福氏佐劑(CFA)混合,加入結(jié)核桿菌H37Ra使結(jié)核菌素補(bǔ)充至400ng,充分混勻至油包水乳劑,制成完全抗原,雙側(cè)背部分4點(diǎn)皮下注射。于免疫后的第0和48h兩次給予小鼠腹腔內(nèi)注射500ng的百日咳毒素,以建立小鼠的EAE模型。免疫當(dāng)天記為0天。VD3組小鼠自免疫當(dāng)天起每隔兩日腹腔注射0.1ml 1,25(OH)2D3(用潔凈蓖麻油稀釋至濃度為1ug/ml),空白對照組和EAE組小鼠均同天腹腔注射0.1ml蓖麻油,直至處死。從免疫當(dāng)天開始,每天早晚(8∶00和16∶00)兩次由兩位觀察者分別對各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能的評分、稱重并給予記錄。于免疫后第20天,對三組小鼠進(jìn)行取材。斷頸處死小鼠后,對小鼠大腦組織新鮮取材,切分成兩部分,前三分之一,后三分之二(此部分以下稱為側(cè)腦室旁腦組織),一部分迅速投入液氮進(jìn)行快速冷凍,后置于一80℃冰箱保存,進(jìn)行Western Blot檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)情況;對脊髓腰骶膨大組織新鮮取材后置于4%多聚甲醛保存,部分制成石蠟切片,進(jìn)行HE、LFB、Nissl染色,觀察炎性細(xì)胞的浸潤、脫髓鞘情況及神經(jīng)元形態(tài)數(shù)目變化;剩余部分的側(cè)腦室旁腦組織和腰骶膨大組織則制成冰凍切片,進(jìn)行免疫熒光法檢測,分別單染Neu N觀察神經(jīng)元的變化,雙染Neu N和Beclin1,Neu N和LC3,觀察神經(jīng)元自噬水平的變化。數(shù)值采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,EAE發(fā)病率應(yīng)用Fisher's確切概率法,臨床評分應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。兩組間炎性浸潤及脫髓鞘對比應(yīng)用t檢驗(yàn)。多組間的計(jì)量資料均數(shù)比較應(yīng)用One-Way ANOVA檢驗(yàn),兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)或Dunnett's檢驗(yàn)。P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1 1,25(OH)2D3有效改善EAE小鼠的臨床癥狀空白對照組(Control組)小鼠均未發(fā)病,活動(dòng)、食欲等方面均正常。EAE組小鼠發(fā)病率達(dá)100%,自免疫第一天即出現(xiàn)不同幅度的體重下降,之后逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少、尾巴無力、反應(yīng)不靈敏和皮毛不光滑等癥狀。1,25(OH)2D3治療組(VD3組)小鼠至取材發(fā)病率僅為11.1%(P0.01)。通過比較后兩組中小鼠每天的神經(jīng)功能評分的均數(shù)發(fā)現(xiàn),自第11天開始,VD3組小鼠的神經(jīng)功能評分顯著地低于EAE組小鼠(第11天,P0.05;之后P0.01)。2 1,25(OH)2D3明顯減輕EAE小鼠脊髓炎性細(xì)胞的浸潤及髓鞘脫失2.1小鼠腰骶膨大組織HE染色示:Control組小鼠未見炎性細(xì)胞的浸潤及“血管袖套”樣情況;處于發(fā)病高峰期的EAE組小鼠脊髓組織切片內(nèi)可見彌漫的炎性細(xì)胞浸潤,個(gè)別的切片內(nèi)存在“血管袖套”樣改變;VD3組小鼠脊髓組織基本未見炎性細(xì)胞浸潤征象。HE染色病理評分存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.2小鼠腰骶膨大LFB染色示:Control組小鼠未見明顯髓鞘脫失情況;EAE組發(fā)病高峰期小鼠脊髓白質(zhì)內(nèi)可見成片的髓鞘脫失區(qū)域,呈現(xiàn)白色空泡樣變;VD3組小鼠脊髓白質(zhì)內(nèi)髓鞘基本完整,未見明顯脫失區(qū)域。LFB染色病理評分存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3 1,25(OH)2D3有效預(yù)防EAE小鼠脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元的脫失3.1小鼠腰骶膨大Nissl染色示:與Control組相比,EAE組小鼠脊髓灰質(zhì)內(nèi)Nissl標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)目顯著減少(P0.01),且呈現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元損傷,如明顯核皺縮、尼氏體數(shù)目減少等現(xiàn)象。而VD3組小鼠脊髓內(nèi)Nissl標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)目則較EAE組增多(P0.01)。3.2免疫熒光染色顯示:與Control組相比,EAE組小鼠脊髓灰質(zhì)內(nèi)Neu N標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)目明顯減少,而VD3組小鼠脊髓內(nèi)Neu N標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)目則較EAE組增多。4發(fā)病高峰期的EAE小鼠體內(nèi)自噬水平存在異常,1,25(OH)2D3可調(diào)控EAE小鼠的自噬水平4.1免疫印跡示:發(fā)病高峰期的EAE小鼠與Control組小鼠相比,Beclin1的表達(dá)明顯下降,差異顯著(P0.05),而VD3組小鼠Beclin1的表達(dá)則較EAE組小鼠明顯升高(P0.05)。而LC3-II在各組的表達(dá)則呈現(xiàn)出相反的趨勢,可見發(fā)病高峰期的EAE小鼠與Control組小鼠相比,LC3-II的表達(dá)明顯升高(P0.01),而VD3組小鼠LC3-II的表達(dá)則較EAE組小鼠明顯降低(P0.05)。增設(shè)EAE氯喹干預(yù)組,顯示發(fā)病高峰期的氯喹治療組小鼠與EAE組小鼠相比,LC3-II的水平未見明顯變化。4.2免疫熒光示:在Control組小鼠神經(jīng)元內(nèi)可檢測到Beclin1呈一定水平的表達(dá),而在發(fā)病高峰期的EAE小鼠神經(jīng)元內(nèi)Beclin1的表達(dá)明顯降低,神經(jīng)元數(shù)目有所減少。在VD3組可見Beclin1表達(dá)彌漫性增強(qiáng)。在Control組及VD3組小鼠神經(jīng)元內(nèi)幾乎檢測不到LC3的表達(dá),而在發(fā)病高峰期的EAE小鼠神經(jīng)元內(nèi)LC3表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論:1自噬參與了多發(fā)性硬化的發(fā)生。在發(fā)病高峰期的EAE小鼠體內(nèi)存在自噬體降解受阻的現(xiàn)象。2 1,25(OH)2D3不僅可以減輕EAE小鼠白質(zhì)炎性脫髓鞘現(xiàn)象,還可以改善神經(jīng)元受損和脫失情況,而1,25(OH)2D3可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元自噬水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。綜上,本實(shí)驗(yàn)證明1,25(OH)2D3及其類似物,或其他神經(jīng)元自噬調(diào)節(jié)劑有望成為治療多發(fā)性硬化的新方向。
【關(guān)鍵詞】：1 25(OH)2D3 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎 多發(fā)性硬化 自噬 神經(jīng)元變性
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R744.5
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-22
• 結(jié)果22-25
• 附圖25-29
• 討論29-32
• 結(jié)論32
• 參考文獻(xiàn)32-36
• 綜述 維生素D、自噬與疾病36-45
• 參考文獻(xiàn)40-45
• 致謝45-46
• 個(gè)人簡歷46

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本文編號：845707