本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ATF5表達(dá)水平對(duì)HCMV復(fù)制的影響機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 人巨細(xì)胞病毒 轉(zhuǎn)錄激活因子5 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞 復(fù)制

【摘要】：目的:1、檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)基因及轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、SY5Y及A172中的表達(dá)水平,為探討HCMV在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的增殖機(jī)制奠定一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。2、下調(diào)ATF5在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、SY5Y中的表達(dá)水平,探討神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ATF5表達(dá)水平對(duì)HCMV復(fù)制水平的影響。方法:1、用HCMV AD169(MOI=5)分別感染U87、SY5Y及A172細(xì)胞,用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。2、用HCMV AD169(MOI=5)分別感染U87、SY5Y及A172細(xì)胞分別在24、48、72、96、120 h取各時(shí)間點(diǎn)上清液,收集上清后通過空斑定量的方法檢測(cè)病毒滴度。3、Real-time PCR檢測(cè)HCMV即刻早期基因(IE2)、早期基因(UL44)、晚期基因(UL99)及ATF5的表達(dá)情況,Western-blot(WB)檢測(cè)病毒基因編碼的蛋白及ATF5表達(dá)的情況。4、通過慢病毒為載體的RNA干擾技術(shù),來(lái)下調(diào)ATF5在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、SY5Y中的表達(dá),在熒光顯微鏡下觀察慢病毒的感染效率,WB檢測(cè)ATF5蛋白干擾的效率,選擇出最佳感染條件和感染參數(shù)。5、下調(diào)ATF5在U87、SY5Y細(xì)胞中表達(dá)后,再用HCMV感染U87、SY5Y細(xì)胞,Real-time PCR及WB檢測(cè)檢測(cè)HCMV基因及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1、HCMV感染U87、SY5Y、A172后觀察細(xì)胞形態(tài)變化,HCMV感染第3-4天U87、SY5Y細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的變化,細(xì)胞觸角由細(xì)長(zhǎng)變粗鈍,細(xì)胞由瘦變粗圓,細(xì)胞之間變得更為聚合,而A172組細(xì)胞則無(wú)明顯變化。2、HCMV感染U87、SY5Y、A172收集不同時(shí)間點(diǎn)的上清,空斑定量檢測(cè)病毒滴度,其中將U87、SY5Y細(xì)胞收集的上清液加入接種HELF的24孔板中,加24、48 h收集的上清液的孔未出現(xiàn)變化,加72 h收集的上清液的孔可檢測(cè)到空斑且隨時(shí)間延長(zhǎng)空斑數(shù)增多,加120 h收集的上清液的孔空斑數(shù)量最多病毒滴度最高;而收集A172細(xì)胞上清液加入接種HELF的24孔板中則無(wú)明顯變化。3、Real-time PCR及WB檢測(cè)顯示,HCMV在U87、SY5Y細(xì)胞中復(fù)制水平與病毒在A172細(xì)胞中復(fù)制水平相比,U87、SY5Y細(xì)胞組明顯高于A172細(xì)胞組(P0.05),ATF5表達(dá)在U87、SY5Y細(xì)胞組與A172細(xì)胞組相比,U87、SY5Y細(xì)胞組ATF5表達(dá)明顯高于A172組(P0.05)。4、HCMV感染U87、SY5Y兩組細(xì)胞后,Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,IE2與ATF5表達(dá)具有明顯正相關(guān)性,U87(r=0.955,P0.05),SY5Y(r=0.956,P0.05)。5、在Complete Medium+5μg/ml Polybrene條件下U87(MOI=1)、SY5Y(MOI=15)慢病毒感染效率最高,在感染后72h時(shí)熒光顯微鏡下可見紅色熒光蛋白,轉(zhuǎn)染效率可達(dá)95%,WB檢測(cè)各組ATF5表達(dá),其中U87細(xì)胞未處理組、陰性對(duì)照CON053組和LV-ATF5-RNAi組ATF5的相對(duì)表達(dá)量分別為0.31±0.02、0.29±0.02、0.07±0.03,SY5Y細(xì)胞未處理組、陰性對(duì)照CON053組和LV-ATF5-RNAi組ATF5的相對(duì)表達(dá)量分別為0.29±0.01、0.28±0.04、0.06±0.03。6、以慢病毒為載體的RNA干擾技術(shù)下調(diào)ATF5在U87、SY5Y細(xì)胞的表達(dá),用HCMV感染細(xì)胞檢測(cè)HCMV基因以及蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果ATF5表達(dá)下調(diào)可抑制HCMV的復(fù)制(P0.05)。結(jié)論:1、HCMV在U87、SY5Y細(xì)胞中復(fù)制水平高于HCMV在A172細(xì)胞中的復(fù)制水平。2、ATF5在U87、SY5Y細(xì)胞中表達(dá)水平均高于ATF5在A172細(xì)胞中表達(dá)水平,推斷HCMV在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中復(fù)制水平可能與ATF5表達(dá)水平相關(guān)。3、下調(diào)ATF5在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)水平可以抑制HCMV的復(fù)制。
【關(guān)鍵詞】：人巨細(xì)胞病毒 轉(zhuǎn)錄激活因子5 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞 復(fù)制
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-10
• 第一章 材料10-13
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備10
• 1.2 主要試驗(yàn)試劑及配制10-12
• 1.3 細(xì)胞及病毒來(lái)源12-13
• 第二章 方法13-24
• 2.1 細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)13-15
• 2.2 HCMV AD169毒株的制備和定量15-16
• 2.3 HCMV AD169感染U87、SY5Y、A172和HELF細(xì)胞16
• 2.4 Real-time PCR分別檢測(cè)HCMV AD169感染U87、SY5Y、A172前后IE2、UL44、UL99及ATF5基因表達(dá)水平的變化16-19
• 2.5 WB分別檢測(cè)HCMV AD169感染U87、SY5Y、A172前后IE2、UL44、UL99及ATF5蛋白表達(dá)水平的變化19-22
• 2.6 慢病毒(LV-ATF5-RNAi)感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87和SY5Y細(xì)胞22
• 2.7 Real-time PCR檢測(cè)干擾ATF5表達(dá)后病毒在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平的變化22-23
• 2.8 WB檢測(cè)干擾ATF5表達(dá)后病毒在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平的變化23
• 2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法23-24
• 第三章 結(jié)果24-41
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)24
• 3.2 HCMV AD169毒株定量24
• 3.3 HCMV AD169感染U87、SY5Y、A172及HELF細(xì)胞其形態(tài)學(xué)變化和病毒滴度測(cè)定24-26
• 3.4 Real-time PCR檢測(cè)HCMV AD169感染U87、SY5Y及A172后其IE2、UL44、UL99及ATF5基因的表達(dá)26-28
• 3.5 West-blot檢測(cè)HCMV AD169感染U87、SY5Y及A172后其IE2、UL44、UL99及ATF5蛋白的表達(dá)28-31
• 3.6 慢病毒感染U87、SY5Y細(xì)胞效率檢測(cè)31-32
• 3.7 慢病毒對(duì)ATF5干擾效率的檢測(cè)32-34
• 3.8 干擾ATF5在表達(dá)后病毒在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平的變化34-36
• 3.9 干擾ATF5表達(dá)病后病毒在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平的變化36-41
• 第四章 討論41-43
• 第五章 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-46
• 文獻(xiàn)綜述46-55
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 攻讀學(xué)位期間研究成果55-56
• 致謝56-57

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 WU LianQiu;ZHANG XueMei;CHE YanChun;ZHANG Ying;TANG SongQing;LIAO Yun;NA RuiXiong;XIONG XiangLin;LIU LongDing;LI QiHan;;A cellular response protein induced during HSV-1 infection inhibits viral replication by interacting with ATF5[J];Science China(Life Sciences);2013年12期

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本文編號(hào)：816888