本文關(guān)鍵詞：泛素化和蘇素化修飾對(duì)α-突觸核蛋白降解的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：α-突觸核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)是一種包含有140個(gè)氨基酸的小分子酸性蛋白質(zhì)。α-Syn普遍存在于腦部神經(jīng)元內(nèi)。α-Syn基因的缺失或突變,會(huì)引起多種神經(jīng)疾病,特別是誘發(fā)常染色體顯性遺傳性帕金森病。然而,α-Syn突變體誘發(fā)帕金森病的確切機(jī)制在很大程上仍未有明確定論。蛋白質(zhì)翻譯后修飾與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系是近年來(lái)的研究熱點(diǎn),尤其是對(duì)蛋白質(zhì)的蘇素化(SUMOylation)、泛素化(Ubiquitination)以及磷酸化(phosphorylation)的研究。但α-Syn的蘇素化、泛素化與α-Syn降解過(guò)程的研究報(bào)道較少。因此,這項(xiàng)研究中,我們主要探討蘇素(Small ubiquitin-related modifier protein,SUMO)和泛素(Ubiquitin)在α-Syn降解途徑中的作用,揭示SUMO和Ubiquitin對(duì)α-Syn的降解通路轉(zhuǎn)換的影響。研究結(jié)果將豐富帕金森病發(fā)病過(guò)程中蛋白質(zhì)降解的機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)首先用兩步法PCR技術(shù)構(gòu)建帶有Flag標(biāo)簽的野生型和突變型Ubiquitin真核表達(dá)質(zhì)粒,即Flag-Ubiquitin WT、K29A、K48A、K63A以及雙突變型G75AG76A。通過(guò)雙酶切和基因測(cè)序確定序列的正確性;通過(guò)Western Blot方法確定重組質(zhì)粒在細(xì)胞上的表達(dá);通過(guò)免疫熒光標(biāo)記技術(shù)了解野生型和突變型Flag-Ubiquitin在細(xì)胞內(nèi)分布特征;通過(guò)LDH和WST-1的檢測(cè)分析野生型和突變型Flag-Ubiquitin的細(xì)胞毒性。發(fā)現(xiàn)野生型和突變型Flag-Ubiquitin多分布于細(xì)胞胞漿,但在細(xì)胞核內(nèi)也有少量分布。突變型FlagUbiquitin均有不同程度的細(xì)胞毒性,其中Flag-Ubiquitin G75AG76A的毒性最大。其次,B103細(xì)胞分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染α-Syn WT和A53T質(zhì)粒,然后用濃度為200μg/m L的Hygromycin B建立具有抗性篩選的穩(wěn)定表達(dá)α-Syn WT、A53T的兩種B103細(xì)胞株。最后,在穩(wěn)定表達(dá)α-Syn WT和A53T的B103細(xì)胞株上,分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Flag-Ubiquitin,通過(guò)免疫熒光標(biāo)記分別檢測(cè)α-Syn與SUMO、Ubiquitin以及與26S蛋白酶體定位結(jié)合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在B103細(xì)胞內(nèi),Ubiquitin與SUMO無(wú)明顯共定位現(xiàn)象,而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染α-Syn的細(xì)胞內(nèi),卻發(fā)現(xiàn)α-Syn與Ubiquitin、SUMO和26S蛋白酶體以及Ubiquitin與SUMO均有明顯的共定位現(xiàn)象,修飾的α-Syn一部分由泛素介導(dǎo)的蛋白酶體系統(tǒng)降解�？傊�,突變型Flag-Ubiquitin產(chǎn)生的細(xì)胞毒性不同,這與它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的分布特征以及形成的聚集體有很大關(guān)系。α-Syn能同時(shí)與Ubiquitin和SUMO結(jié)合,被泛素和SUMO修飾,形成α-Syn的泛素復(fù)合物以及α-Syn的SUMO復(fù)合物,并且在Ubiquitin與SUMO兩者之間,可能存在著某種機(jī)制能夠使Ubiquitin與SUMO相互作用共同修飾α-Syn,修飾的α-Syn一部分經(jīng)由泛素介導(dǎo)的蛋白酶體系統(tǒng)降解。
【關(guān)鍵詞】：帕金森病 α-突觸核蛋白 蘇素 泛素 泛素蛋白酶體系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R742.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 1 引言10-18
• 1.1 帕金森病及其病理學(xué)特征10
• 1.2 α-突觸核蛋白 (α-Syn)10-12
• 1.2.1 α-Syn的分子結(jié)構(gòu)特征10-11
• 1.2.2 α-Syn的聚集與路易包涵體的形成11-12
• 1.2.3 α-Syn與氧化應(yīng)激12
• 1.3 α-Syn的蛋白質(zhì)翻譯后修飾——SUMO化和泛素化修飾12-15
• 1.3.1 α-Syn的蘇素化修飾 (SUMOylation)13-14
• 1.3.2 α-Syn的泛素化修飾 (ubiquitination)14-15
• 1.4 α-Syn的降解通路15-18
• 1.4.1 自噬溶酶體途徑 (ALP)16
• 1.4.2 泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解系統(tǒng) (UPS)16-18
• 2 材料與方法18-32
• 2.1 構(gòu)建 α-Syn突變型和Flag-Ubiquitin野生型及突變型重組質(zhì)粒質(zhì)粒18-24
• 2.1.1 主要儀器與設(shè)備18
• 2.1.2 常用試劑及配制18-20
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)步驟20-24
• 2.2 突變體 α-Syn G51D和Flag-Ubiquitin野生型和突變型重組載體的表達(dá)與穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立24-29
• 2.2.1 主要儀器與設(shè)備24-25
• 2.2.2 常用試劑及配制25-26
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟26-29
• 2.3 免疫熒光標(biāo)記和細(xì)胞活性、凋亡檢測(cè)29-32
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備29
• 2.3.2 常用試劑及配制29-30
• 2.3.3 實(shí)驗(yàn)步驟30-32
• 3 結(jié)果與分析32-50
• 3.1 突變型 α-Syn G51D和野生型及突變型Flag-Ubiquitin重組質(zhì)粒的構(gòu)建以及在B103細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)32-34
• 3.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建32-33
• 3.1.2 重組質(zhì)粒在B103細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)檢測(cè)33-34
• 3.2 重組質(zhì)粒 α-Syn、Flag-Ubiquitin野生型及其突變型在細(xì)胞內(nèi)的分布和對(duì)細(xì)胞存活的影響34-38
• 3.2.1 α-Syn野生型及其突變體在B103細(xì)胞內(nèi)的分布及細(xì)胞毒性檢測(cè)34-36
• 3.2.2 Flag-Ubiquitin野生型及其突變體細(xì)胞內(nèi)的分布及細(xì)胞毒性檢測(cè)36-38
• 3.3 重組質(zhì)粒 α-Syn穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立38-40
• 3.3.1 重組質(zhì)粒 α-Syn穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的篩選38-39
• 3.3.2 重組質(zhì)粒Flag-Ubiquitin在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)39-40
• 3.4 重組質(zhì)粒Flag-Ubiquitin在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)對(duì) α-synuclein的影響40-45
• 3.4.1 B103細(xì)胞內(nèi)，重組質(zhì)粒Flag-Ubiquitin與 26S蛋白酶體定位結(jié)合40-41
• 3.4.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)，重組質(zhì)粒Flag-Ubiquitin與 26S蛋白酶體定位結(jié)合41
• 3.4.3 B103細(xì)胞內(nèi)，，重組質(zhì)粒Flag-Ubiquitin與內(nèi)源性Ubiquitin的分布41-43
• 3.4.4 α-Syn與Ubiquitin的定位結(jié)合情況43
• 3.4.5 α-Syn與 26S蛋白酶體的定位結(jié)合情況43-45
• 3.5 SUMO在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)對(duì) α-Syn的影響45-50
• 3.5.1 SUMO與 α-Syn的定位結(jié)合情況45-46
• 3.5.2 在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)lag-Ubiquitin與SUMO的相互作用46-50
• 4 結(jié)論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 致謝58-60
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文60-61

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