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重組微小腺病毒載體對(duì)Wilson病患者皮膚成纖維細(xì)胞銅代謝的影響

發(fā)布時(shí)間:2017-06-12 14:00

  本文關(guān)鍵詞:重組微小腺病毒載體對(duì)Wilson病患者皮膚成纖維細(xì)胞銅代謝的影響,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。


【摘要】:研究背景Wilson病又稱(chēng)肝豆?fàn)詈俗冃?由ATP7B基因突變引起的常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙疾病。目前Wilson病的治療方法主要包括:①鋅劑治療,②以金屬絡(luò)合劑為代表的驅(qū)銅治療,③肝移植治療。以青霉胺為代表的金屬絡(luò)合劑屬于對(duì)癥驅(qū)銅治療,其對(duì)早期階段Wilson病有一定療效,部分患者經(jīng)治療后得以基本恢復(fù)正常的工作和生活,但患者須終身服藥,且藥物副作用大,高達(dá)70%的患者出現(xiàn)副作用,部分患者難以堅(jiān)持。肝移植治療,因其肝來(lái)源有限、存在免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題,故臨床應(yīng)用有限;谏鲜鰝鹘y(tǒng)治療的局限性,人們開(kāi)始逐步探討Wilson病的基因治療。Wilson病是單基因遺傳病,基因治療是最根本的治療方法。目的探討重組微小腺病毒載體miniAd-ATP7B-GFP對(duì)高銅孵育下的Wilson病患者皮膚成纖維細(xì)胞銅代謝的影響。方法構(gòu)建含人ATP7B基因的重組微小腺病毒載體;檢測(cè)8例Wilson病患者的突變基因;原代培養(yǎng)8例Wilson病患者與8名健康對(duì)照的皮膚成纖維細(xì)胞,使用基本培養(yǎng)液及銅濃度為22.30(C1)、89.20(C2)、156.1(C3)、245.3 μmol/L (C4)培養(yǎng)液分別孵育2組細(xì)胞72 h,檢測(cè)銅與蛋白含量。向Wilson病患者成纖維細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染ATP7B重組微小腺病毒載體miniAd-ATP7B-GFP (miniAd-ATP7B-GFP組)與空載體病毒(miniAd-GFP組),設(shè)立Wilson病未轉(zhuǎn)染組及健康組做對(duì)照,用C4濃度培養(yǎng)液孵育4組細(xì)胞72、96h,后檢測(cè)各組細(xì)胞銅與蛋白含量。結(jié)果8例Wilson病患者檢出5種突變基因,基本培養(yǎng)液及C1~C3組Wilson病患者與健康人銅/蛋白比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,C4組Wilson病患者[(1871.6±209.2)ng/mg]與健康入[(1267.2±188.3)ng/mg]銅/蛋白比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.075,P0.01),C3、C4組較基本培養(yǎng)液組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(患者組x2=31.493,健康組貯=30.708,均P0.01)。96 h各組銅/蛋白比值均高于72 h組,96 h、72 h的miniAd-ATP7B-GFP組銅/蛋白比值[96h(2071.0±171.8)ng/mg,72 h(1495.5±161.4)ng/mg]與Wilson病未轉(zhuǎn)染組[96 h(2731.2±188.7)ng/mg,72 h(1901.7±219.5)ng/mg]相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(72 h組F=20.130,96 h組F=51.496,P0.01),與健康組比差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論MiniAd-ATP7B-GFP對(duì)高銅孵育下的Wilson病患者皮膚成纖維細(xì)胞的銅代謝有部分改善作用。
【關(guān)鍵詞】:肝豆?fàn)詈俗冃?/strong> 皮膚成纖維細(xì)胞 銅濃度
【學(xué)位授予單位】:安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類(lèi)號(hào)】:R742.4
【目錄】:
  • 中英文縮略表6-7
  • 摘要7-8
  • Abstract8-10
  • 1 前言10-14
  • 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法14-31
  • 2.1 實(shí)驗(yàn)材料14-17
  • 2.1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本14-15
  • 2.1.2 主要儀器15-16
  • 2.1.3 主要試劑16-17
  • 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-31
  • 2.2.1 試劑的配制17-18
  • 2.2.2 構(gòu)建構(gòu)建含ATP7B基因的重組穿梭質(zhì)粒18-26
  • 2.2.3 miniAd5-ATP7B-EGFP重組腺病毒包裝與純化26-28
  • 2.2.4 直接測(cè)序法檢測(cè)突變基因28
  • 2.2.5 皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)28
  • 2.2.6 皮膚成纖維細(xì)胞波形蛋白免疫化學(xué)鑒定28-29
  • 2.2.7 高銅孵育皮膚成纖維細(xì)胞29
  • 2.2.8 腺病毒轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞29-30
  • 2.2.9 銅含量與蛋白含量測(cè)定30-31
  • 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法31
  • 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-35
  • 4 討論35-38
  • 5 結(jié)論38
  • 參考文獻(xiàn)38-43
  • 綜述43-49
  • 參考文獻(xiàn)47-49

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  本文關(guān)鍵詞:重組微小腺病毒載體對(duì)Wilson病患者皮膚成纖維細(xì)胞銅代謝的影響,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào):444155


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