本文關(guān)鍵詞：新型組織工程神經(jīng)導(dǎo)管的構(gòu)建及其對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：周圍神經(jīng)損傷在臨床工作中比較常見,在外傷患者中,約有2.8%的病例伴有不同程度的周圍神經(jīng)損傷。對(duì)于短距離的神經(jīng)損傷,可以通過斷端直接吻合的方法來修復(fù),但是對(duì)于長距離的神經(jīng)缺損,則必須給予一個(gè)適宜生長的環(huán)境才能引導(dǎo)神經(jīng)纖維的延伸。目前對(duì)于長距離的神經(jīng)缺損通常采用移植物橋接的方式,常用的移植物主要有神經(jīng),靜脈或者動(dòng)脈等等。但是,這些方法都有一些不可避免的缺點(diǎn),比如移植材料來源的短缺,額外的創(chuàng)傷以及供區(qū)的功能障礙。另外供體移植物的大小也不能很好的適應(yīng)待修復(fù)的神經(jīng),異體移植的免疫排斥反應(yīng)等等。而最近興起的組織工程神經(jīng)被認(rèn)為是有希望的替代方案,應(yīng)用組織工程的方法構(gòu)建神經(jīng)移植物,能夠很好的解決上述的問題。對(duì)于理想的組織工程神經(jīng),要求其具有良好的生物相容性,生物降解性,并且能夠引導(dǎo)和促進(jìn)損傷神經(jīng)的再生。在本文中我們先后構(gòu)建了三種人工神經(jīng)應(yīng)用于周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)。分別為PLGA復(fù)合自聚合肽納米材料,PLGA復(fù)合自聚合肽納米材料及施萬細(xì)胞和PLGA復(fù)合有序膠原蛋白支架構(gòu)建的人工神經(jīng)。施萬細(xì)胞(Schwann cells,SCs)是周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞,它能分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子,產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞粘附因子,并且與多種生物材料具有良好的相容性。在我們用到的材料中自聚合肽納米材料(self assembling peptide nanofiber scaffold, SAPNS)是最近興起的生物材料,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于組織工程中。與傳統(tǒng)材料相比,其纖維構(gòu)成和孔徑能夠更好的模擬細(xì)胞外基質(zhì),有利于細(xì)胞的生長。PLGA全稱是聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)),具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜性,被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域。在美國,PLGA通過了FDA的認(rèn)證,作為藥用輔料收錄進(jìn)美國藥典。膠原蛋白是細(xì)胞外間質(zhì)的重要組成部分,它的分布遍及全身各個(gè)組織器官。膠原蛋白有著諸多的優(yōu)點(diǎn),在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用甚為廣泛且發(fā)展迅速,包括作為藥物傳遞系統(tǒng),外科縫線、止血?jiǎng)┑?在組織工程中更是一個(gè)很重要的研究材料。通過以上材料的互相結(jié)合,我們構(gòu)建了三種組織工程神經(jīng),并檢測了其對(duì)神經(jīng)損傷再生的促進(jìn)作用。材料和方法L人工神經(jīng)導(dǎo)管的制備1.1 PLGA管的制備：將PLGA顆粒溶于三氯甲烷中攪拌24 h至均勻,制成5%的PLGA溶液,其中PLA:PGA為85：15。將相同于溶液中溶質(zhì)質(zhì)量的氯化鈉顆粒(96-75 μ m)加入到溶液中攪拌24h后將已經(jīng)配制好的溶液漿料迅速倒入聚四氟乙烯模具中成型為管狀體并置于冷凍干燥機(jī)中凍干2h,將成型的導(dǎo)管用蒸餾水洗6次去除材料中的氯化鈉顆粒,然后再用DMEM/F12培養(yǎng)液中沖洗3次,備用。1.2施萬細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定：取兩周齡大鼠,截取坐骨神經(jīng),用反復(fù)植塊法培養(yǎng)純化施萬細(xì)胞。1.3膠原蛋白有序支架材料的制備：提取大鼠鼠尾膠原,通過冷凍干燥和物理拉伸制備內(nèi)部含有有序細(xì)微管道的線性膠原支架。1.4人工神經(jīng)導(dǎo)管的制備：PLGA+SAPNS:PLGA管內(nèi)填充20μ1 SAPNS,然后在DMEM/F12培養(yǎng)液中浸泡30分鐘,使自聚合肽聚合成為凝膠狀。PLGA+SAPNS+SCs:將2.5×105個(gè)SCs混入20μ1 SAPNS,然后填充到PLGA管內(nèi),DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡30mmin,使自聚合肽聚合成為凝膠狀。PLGA+collagen:將上述制備的膠原支架填充到到PLGA管內(nèi),DMEM/F12培養(yǎng)液中浸泡30分鐘,備用。2.大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型制備及人工神經(jīng)導(dǎo)管移植： 暴露大鼠坐骨神經(jīng)后切除部分神經(jīng)造成10mm的缺損,用上述構(gòu)建的人工神經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)行移植修復(fù)。另設(shè)神經(jīng)移植陽性對(duì)照組(peripheral nerve, PN)、單純?nèi)睋p無移植的陰性對(duì)照組(non graft, NG)和假手術(shù)組(sham)。 PN的移植物為從同種SD大鼠所取下的l0mm坐骨神經(jīng)。NG只做神經(jīng)缺損,不做修復(fù)處理。sham僅暴露坐骨神經(jīng)但不做損傷。3.行為學(xué)功能檢測：使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在100cm長,寬10cm的長方體通道中行走,將其前腳掌涂無毒染料,訓(xùn)練其走窄跑道。動(dòng)物熟練行走后進(jìn)行測試三次。首先,我們分析了損傷側(cè)后肢著地方式,然后在得到的完整足印上測量前后腳掌掌心距和腳掌與動(dòng)物前進(jìn)方向的夾角。4.神經(jīng)電生理檢測：大鼠麻醉后重新暴露坐骨神經(jīng),將刺激電極和參考電極分別置于移植物近側(cè)端的宿主神經(jīng)干,記錄電極置于同側(cè)腳掌掌心。然后記錄復(fù)合肌誘發(fā)動(dòng)作電位(compound muscle action potential, CMAP)。從所獲得的電生理CMAP圖形測量其神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期(latency)和復(fù)合動(dòng)作電位的波幅(amplitude)。5.熒光金逆行示蹤檢測：電生理檢測后,通過顯微注射將2 ul 1%的熒光金注射于移植物遠(yuǎn)端5mm處。注射后7d,處死動(dòng)物,觀察標(biāo)記結(jié)果。6.組織收集：注射熒光金7d后,麻醉動(dòng)物,取出雙側(cè)腓腸肌稱重,計(jì)算濕重比。0.1M PBS和多聚甲醛灌注,取材收集坐骨神經(jīng)和L5脊髓節(jié)段。部分樣本用2.5%戊二醛加2%多聚甲醛固定以備透射電子顯微鏡檢測,4%的多聚甲醛固定以備冰凍切片和免疫熒光染色。7.免疫熒光檢測：用于免疫熒光染色的樣品經(jīng)過4%多聚甲醛固定24 h后梯度蔗糖脫水,OCT包埋后冰凍切片,厚度20 μm,切片保存在-20℃待用。在每個(gè)組織的切片中,間隔10片取出1片,進(jìn)行NF-200/MBP免疫組化雙染色檢測軸突和髓鞘,熒光顯微鏡觀察和拍照。8.透射電鏡觀察：取移植物中段1mm標(biāo)本,2.5%戊二醛和2%多聚甲醛固定24 h后,樣品經(jīng)過梯度丙酮脫水,在1%Os04中4℃處理2h。然后將樣品用樹脂包埋后進(jìn)行超薄切片,2%醋酸鈾和檸檬酸鉛復(fù)染,用透射電子顯微鏡觀察髓鞘和神經(jīng)纖維生長情況并拍照,測量分析各組差異。9.腓腸肌組織學(xué)檢測：取腓腸肌中段5mm×2mm×2 mm組織塊浸入多聚甲醛固定過夜,梯度蔗糖脫水,OCT包埋劑包埋后進(jìn)行冰凍切片,厚度10 μ m。隔10張取一張進(jìn)行蘇木素染色,光鏡觀察,并采用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測量放大20倍視野下各組腓腸肌纖維面積。10.運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元定量分析：脊髓L5節(jié)段冰凍切片,厚度10μm。每隔10片取1片進(jìn)行熒光Nissl染色標(biāo)記存活神經(jīng)元。統(tǒng)計(jì)熒光金標(biāo)記的再生神經(jīng)元占存活運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的比例,同時(shí)根據(jù)損傷側(cè)和正常側(cè)神經(jīng)元的比值,計(jì)算神經(jīng)元存活的比例。11.運(yùn)動(dòng)終板檢測：取固定后的中段腓腸肌,每個(gè)組織分別進(jìn)行冰凍切片縱切,厚度10μm,縱切片用α-銀環(huán)蛇毒素(α-BTX)染色標(biāo)記運(yùn)動(dòng)終板。染色結(jié)果顯微觀察并拍照,每個(gè)標(biāo)本選取六個(gè)不重疊的視野,用Image Pro Plus統(tǒng)計(jì)運(yùn)動(dòng)終板的面積和腓腸肌的肌纖維橫切面積。結(jié)果1.行為學(xué)檢測后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)：與單純損傷無移植的NG相比,人工神經(jīng)或周圍神經(jīng)移植后大鼠損傷側(cè)后肢行為學(xué)檢測各項(xiàng)指標(biāo)均有較顯著的改善。提示坐骨神經(jīng)有不同程度的再生使得靶區(qū)肌組織能在神經(jīng)支配下恢復(fù)部分運(yùn)動(dòng)功能。2.神經(jīng)電生理檢測損傷坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)功能：通過電生理波形分析,可見坐骨神經(jīng)缺損后CMAP波形基本消失,神經(jīng)導(dǎo)管或周圍神經(jīng)移植后CMAP有不同程度的恢復(fù)。其中上述人工神經(jīng)導(dǎo)管移植組的神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期(latency)和復(fù)合動(dòng)作電位的波幅(amplitude)的數(shù)值介于PLGA空套管組和PN之間。提示人工神經(jīng)導(dǎo)管對(duì)恢復(fù)神經(jīng)傳導(dǎo)功能有一定的效果。3.軸突的再生情況：標(biāo)本取材后可見人工神經(jīng)導(dǎo)管或周圍神經(jīng)移植組的宿主神經(jīng)干與移植物之間沒有明顯的瘢痕組織出現(xiàn)。將縱切片標(biāo)本做NF-200免疫組化后可以看到在移植區(qū)有大量NF-200陽性的再生軸突,軸突排列比較規(guī)則,基本平行于神經(jīng)長軸,大部分軸突通過移植區(qū)進(jìn)入到尾側(cè)神經(jīng)干。在NF-200免疫組化染色的橫切片上可以看到,再生軸突較均勻分布于整個(gè)移植的管道。4.再生軸突的髓鞘化：NF-200和MBP免疫熒光雙染或透射電鏡結(jié)果可見,在各組移植區(qū)橫切片均可見不同程度的NF-200陽性軸突及其周圍包繞的MBP陽性髓鞘。相對(duì)而言,三種人工神經(jīng)導(dǎo)管移植區(qū)內(nèi)的軸突密度和直徑、軸突髓鞘化比例,以及髓鞘的厚度仍較顯著低于假手術(shù)組和周圍神經(jīng)移植組,但顯著高于PLGA空套管組。5.神經(jīng)元的存活和再生：脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)出的軸突參與了坐骨神經(jīng)組成,所以坐骨神經(jīng)橫斷可導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元的損傷。通過熒光Nissl染色顯示神經(jīng)元并將損傷側(cè)與對(duì)照側(cè)比較,發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活率在各移植組之間沒有顯著性差異。同時(shí)比較熒光金陽性標(biāo)記的再生神經(jīng)元占存活神經(jīng)元的比例,提示人工神經(jīng)導(dǎo)管移植能顯著提高再生運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的比例,但與周圍神經(jīng)移植組間仍有差異。6.腓腸肌萎縮情況：坐骨神經(jīng)缺損可導(dǎo)致其所支配的腓腸肌明顯萎縮,肌纖維脂肪變性,在單純損傷組由于沒有有效的治療,肌肉萎縮的情況最明顯,而在各個(gè)治療組,萎縮程度有著明顯的改善。統(tǒng)計(jì)肌纖維的橫切面積和腓腸肌的濕重比,各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7.運(yùn)動(dòng)終板的形態(tài)分析：用α-BTX標(biāo)記神經(jīng)肌肉接觸位置的運(yùn)動(dòng)終板,從運(yùn)動(dòng)終板的面積可以看出,各組的運(yùn)動(dòng)終板面積都有不同程度的下降,均低于假手術(shù)組。運(yùn)動(dòng)終板面積減小最明顯的是單純損傷,其次是三種人工神經(jīng)組,周圍神經(jīng)組與正常動(dòng)物的差異不明顯。在本實(shí)驗(yàn)研究中,我們?cè)O(shè)計(jì)了三種新型的組織工程人工神經(jīng)材料,它是由PLGA材料構(gòu)成的導(dǎo)管支撐,內(nèi)部分別填充了自聚合肽納米材料(SAPNS)、混合施萬細(xì)胞的SAPNS和線性有序膠原支架。利用大鼠坐骨神經(jīng)缺損10mm的損傷模型檢測其促周圍神經(jīng)再生的效果,同時(shí)利用假手術(shù)、同源周圍神經(jīng)、PLGA空導(dǎo)管和單純損傷等分別作為陽性或陰性對(duì)照。經(jīng)過電生理、行為學(xué)、組織學(xué)和神經(jīng)束路示蹤等檢測手段,評(píng)價(jià)缺損神經(jīng)的軸突再生、髓鞘化、神經(jīng)傳導(dǎo)以及后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)等情況。綜合各項(xiàng)檢測指標(biāo)可見,本課題所構(gòu)建的三種新型人工神經(jīng)導(dǎo)管均能較好地橋接缺損的周圍神經(jīng),可促進(jìn)軸突再生及髓鞘化,同時(shí)神經(jīng)傳導(dǎo)功能及靶區(qū)運(yùn)動(dòng)功能均有不同程度的恢復(fù)。同時(shí),本研究結(jié)果也提示,上述導(dǎo)管促神經(jīng)再生的效果與周圍神經(jīng)移植組相比還有差距。本課題組將根據(jù)本研究的結(jié)果和提示,對(duì)所構(gòu)建的人工神經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)一步完善和改進(jìn),不斷提高周圍神經(jīng)缺損修復(fù)的效果。
【關(guān)鍵詞】：周圍神經(jīng)損傷 人工神經(jīng) 自聚合肽納米纖維材料 PLGA 膠原蛋白 施萬細(xì)胞 神經(jīng)再生 髓鞘化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R745.4
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-29
• 參考文獻(xiàn)25-29
• 第一部分 PLGA復(fù)合自聚合肽納米材料修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損29-53
• 引言29-30
• 材料和方法30-35
• 結(jié)果35-41
• 討論41-43
• 附圖43-51
• 參考文獻(xiàn)51-53
• 第二部分 PLGA復(fù)合自聚合肽納米材料填充施萬細(xì)胞修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損53-75
• 引言53-54
• 材料和方法54-58
• 結(jié)果58-62
• 討論62-64
• 附圖64-73
• 參考文獻(xiàn)73-75
• 第三部分 PLGA復(fù)合有序膠原蛋白支架構(gòu)建仿生人工神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損75-96
• 引言75-76
• 材料和方法76-79
• 結(jié)果79-83
• 討論83-85
• 附圖85-94
• 參考文獻(xiàn)94-96
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果96-98
• 致謝98-100

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Ping Zhang;Xiaocheng Lu;Jianghai Chen;Zhenbing Chen;;Schwann cells originating from skin-derived precursors promote peripheral nerve regeneration in rats[J];Neural Regeneration Research;2014年18期

  本文關(guān)鍵詞：新型組織工程神經(jīng)導(dǎo)管的構(gòu)建及其對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：400630