本文關(guān)鍵詞：SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。既往研究認(rèn)為成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞無(wú)再生能力,當(dāng)成年動(dòng)物腦或脊髓內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞因損傷、疾病及自然凋亡等因素逐漸減少,而不能被其他細(xì)胞更新、替代；進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)是一種具有多分化潛能細(xì)胞,能通過(guò)對(duì)稱分裂、不對(duì)稱分裂產(chǎn)生子代神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。假如能夠?qū)⑸窠?jīng)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化,并且通過(guò)移植進(jìn)入機(jī)體,可能可以為治療以帕金森病為代表的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供一個(gè)新的途徑。目的：從孕14d胚胎SD大鼠(Sprague-Dawley,SD)中腦分離神經(jīng)干細(xì)胞,并且進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定。方法：1.神經(jīng)干細(xì)胞的分離：取孕14d胚胎SD大鼠斷頭處死,置于體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇中浸泡消毒15 min,無(wú)菌條件下取出全腦,置于PBS培養(yǎng)皿中,切除小腦、腦干、腦膜、血管等,無(wú)菌解剖分離胚胎腹側(cè)中腦組織,并且剪成1 mm3的碎塊,D-Hanks液漂洗后,火焰拋光的吸管吹打、200目篩網(wǎng)過(guò)濾制備成單細(xì)胞懸液。離心(800 r/min,離心半徑10cm) 5min×3次,去除上清液,調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/ml,神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液DMEM/F12(Hyclone)、1% N2(Gibeo).20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(RD Systems),20 ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子(R8LD Systems)],37℃,5%CO2培養(yǎng)。2.神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)：用不含血清的培養(yǎng)基(DMEM/F12,堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、N2)培養(yǎng),每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,2-3 d半量換液,5-7 d即可傳代。傳代時(shí),離心收集神經(jīng)球,機(jī)械吹打使其分散成單個(gè)細(xì)胞,以1×105個(gè)/ml的密度傳代,37℃,5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。比較分離效果時(shí),倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),測(cè)定第3代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。3.神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定：離心收集神經(jīng)球,以神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)液VDMEM/F12、1%胎牛血清(Gibeo)、1%N2]重懸,接種于預(yù)先放置多聚賴氨酸包被蓋玻片的培養(yǎng)板中,37℃,5%CO2培養(yǎng)1 h,進(jìn)行Nestin(Abeam)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。4.神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：離心收集神經(jīng)球,以神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)液(DMEM/F12、1%胎牛血清、1%N2)重懸,接種于預(yù)先放置多聚賴氨酸包被蓋玻片的培養(yǎng)板中,370℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。每天觀察細(xì)胞的分化情況,7 d后分別進(jìn)行CD11c、GFAP和NeuN免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定細(xì)胞的分化情況。結(jié)果：1.神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：24h后,大部分細(xì)胞貼壁,單個(gè)或成對(duì)存在；48h后,可見(jiàn)到啞鈴型的細(xì)胞分裂相；72h后,數(shù)十個(gè)細(xì)胞聚集成細(xì)胞團(tuán),懸浮生長(zhǎng)；繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞迅速增加,細(xì)胞團(tuán)不斷增大,細(xì)胞團(tuán)逐漸形成神經(jīng)球(neu-rosphere);6-7d后神經(jīng)球長(zhǎng)大至200μm左右即可傳代。2.神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定：第3代神經(jīng)球置于神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h后貼壁,使用神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物Nestin;進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,結(jié)果顯示Nestin免疫反應(yīng)陽(yáng)性。3.神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：第3代神經(jīng)球置于神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h后貼壁,培養(yǎng)72h后大量細(xì)胞從神經(jīng)球中長(zhǎng)出突起。7d后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。結(jié)果顯示NeuN免疫反應(yīng)陽(yáng)性的為神經(jīng)元,GFAP免疫反應(yīng)陽(yáng)性的為星形膠質(zhì)細(xì)胞,CDllc免疫反應(yīng)陽(yáng)性的為少突膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)論：分離和培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過(guò)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物Nestin進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果呈陽(yáng)性,誘導(dǎo)分化的細(xì)胞分別使用GFAP、CD11c、NeuN進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果呈陽(yáng)性,并且具有很強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能,證明分離培養(yǎng)的細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞,證明胚胎SD大鼠中腦存在神經(jīng)干細(xì)胞,可能可以為治療以帕金森病為代表的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病提供一個(gè)新的途徑。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)干細(xì)胞 分離培養(yǎng) 鑒定
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R742.5
【目錄】：

• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 符號(hào)說(shuō)明13-15
• 引言15-17
• 1. 材料17-21
• 1.1 主要儀器設(shè)備17-18
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料18-19
• 1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物19
• 1.4 試劑配制19-21
• 2. 方法21-26
• 2.1 神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)21-24
• 2.1.1 原代細(xì)胞的培養(yǎng)21-22
• 2.1.2 神經(jīng)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)22-23
• 2.1.3 死活細(xì)胞的分離23
• 2.1.4 神經(jīng)干細(xì)胞的凍存23
• 2.1.5 神經(jīng)干細(xì)胞的復(fù)蘇23-24
• 2.2 神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定24-25
• 2.2.1 Nestin免疫熒光化學(xué)染色24
• 2.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞的分化鑒定24-25
• 2.3 神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化25-26
• 3. 結(jié)果26-32
• 3.1 神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)26-28
• 3.1.1 原代細(xì)胞的培養(yǎng)26-27
• 3.1.2 神經(jīng)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)27-28
• 3.2 神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的鑒定28-30
• 3.3 神經(jīng)干細(xì)胞的復(fù)蘇30-32
• 4. 討論32-36
• 5. 結(jié)論36-37
• 參考文獻(xiàn)37-41
• 綜述41-47
• 參考文獻(xiàn)45-47
• 論文發(fā)表情況47-48
• 致謝48

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 錢曉丹;羅春霞;朱東亞;;神經(jīng)干細(xì)胞移植研究進(jìn)展[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2012年03期

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  本文關(guān)鍵詞：SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：392671