本文關(guān)鍵詞：正丁基苯酞對腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)作用的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:腦血管病是我國居民死亡的首要原因和造成成人殘疾的第一原因,其中以缺血性腦血管病最為常見。雖然神經(jīng)元不能再生,但是臨床資料顯示,存活的腦卒中患者,均顯示出不同程度的功能恢復(fù),提示腦組織具有自我修復(fù)能力。近年來,科學(xué)家們不斷發(fā)現(xiàn)神經(jīng)可塑性在腦卒中患者和腦梗死動(dòng)物模型中起到功能恢復(fù)的作用。神經(jīng)可塑性從組織結(jié)構(gòu)層面來講指的是軸突、樹突的分支,樹突棘的密度,突觸數(shù)量和大小,受體的密度和某些大腦區(qū)域神經(jīng)元的數(shù)量等。這些結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和腦卒中后的功能恢復(fù)基礎(chǔ)。因此,如何提高腦梗死后神經(jīng)的可塑性為臨床治療腦梗死提供了新的治療策略。Sonic hedgehog(Shh)信號通路是一高度保守的分泌性糖蛋白,是hedgehog蛋白家族三大成員Sonic hedgehog(Shh),Desert hedgehog(Dhh)和Indian hedgehog(Ihh)之一。當(dāng)Shh蛋白與Ptch結(jié)合后,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Gli家族轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的促存活反應(yīng)。脊椎動(dòng)物的Gli家族包括Gli1、Gli2和Gli3,其激活后由胞漿轉(zhuǎn)位至胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。研究顯示Shh信號通路在胚胎期中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起重要作用,它可以調(diào)控細(xì)胞的分化和增殖,同時(shí)它可以在腦損傷后誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞再生,參與血管重構(gòu)。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腦梗死后Shh信號通路重新激活,皮層缺血組織的Shh/Ptch1/Gli1表達(dá)較對照組顯著增加,特異性阻斷Shh/Ptch1/Gli1信號通路后,神經(jīng)功能損傷加重,腦梗死體積增大,提示Shh信號通路在腦卒中后神經(jīng)保護(hù)治療中起重要作用。生長相關(guān)蛋白43(Growth Associated Protein 43,GAP43)可以高水平表達(dá)于神經(jīng)元軸突發(fā)育過程中,是軸突和突觸前的重要組成部分。GAP43在大腦發(fā)育、腦損傷或腦缺血過程中可被用作為一個(gè)新的軸突生長的可靠的標(biāo)志。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的蛋白質(zhì)。BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中,對神經(jīng)元的分化、生長及存活發(fā)育起重要作用,并且其能防止神經(jīng)元受損傷死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進(jìn)受損傷神經(jīng)元再生及分化等生物效應(yīng)。因此BDNF是成熟的中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元維持生存及正常生理功能所必需的蛋白質(zhì)。正丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)又名丁苯酞,是我國自主研發(fā)的治療缺血性腦血管病的國家一類新藥。NBP最初是由芹菜籽中提取而來。以往的研究已經(jīng)證明NBP具有較強(qiáng)的抗腦缺血作用:明顯改善腦缺血區(qū)微循環(huán)和血流量,增加缺血區(qū)毛細(xì)血管數(shù)量,縮小梗死面積,減輕腦水腫,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,改善能量代謝,抑制血栓形成及血小板聚集等。但是有關(guān)NBP對卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)性小鼠局灶性大腦中動(dòng)脈皮層梗死(distal middle cerebral artery occlusion,d MCAO)模型的基礎(chǔ)上觀察腦缺血后應(yīng)用NBP,從手術(shù)后急性期至術(shù)后4周腦缺血損傷后其神經(jīng)保護(hù)作用,NBP對Shh/Ptch1/Gli1通路和GAP43和BDNF因子的影響以及NBP對于軸突和樹突,樹突棘的影響。方法:實(shí)驗(yàn)分為三部分:實(shí)驗(yàn)一,NBP的腦保護(hù)作用研究;實(shí)驗(yàn)二,NBP治療組的Shh/Ptch1/Gli1及GAP43和BDNF含量變化;實(shí)驗(yàn)三,NBP對于軸突與樹突和樹突棘神經(jīng)可塑性觀察。實(shí)驗(yàn)一:采用成年健康雄性C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、溶劑對照組(Vehicle)、NBP小劑量(20mg/kg)組(NBP-L)、及NBP大劑量(40 mg/kg)組(NBP-H)。制作小鼠局灶性大腦中動(dòng)脈皮層梗死模型(distal middle cerebral artery occlusion,d MCAO)。制備梗死模型1小時(shí)后立即于腹腔給予NBP(20 mg/kg或40 mg/kg),或溶劑Tween-80(0.5%)。手術(shù)分為急性期和慢性期兩組。急性期于術(shù)后第3天至5天,7天至9天,14天至16天,慢性期于術(shù)后第14天至16天及28天至30天分別進(jìn)行Rotarod Test神經(jīng)功能評分。實(shí)驗(yàn)二:采用成年健康雄性C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、溶劑對照組(Vehicle)、NBP小劑量(20mg/kg)組(NBP-L)、及NBP大劑量(40 mg/kg)組(NBP-H)。干預(yù)組采取腹腔給藥。采用免疫組化法(Immunohistochemistry,IHC),免疫熒光共聚焦技術(shù)(Confocol Technique)檢測GAP43是否表達(dá)及表達(dá)位置,蛋白印跡法(Western Blot)測定Shh/Ptch1/Gli1以及GAP43和BDNF的蛋白水平。實(shí)驗(yàn)三:采用成年健康雄性C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、溶劑對照組(Vehicle)、NBP小劑量(20mg/kg)組(NBP-L)、及NBP大劑量(40 mg/kg)組(NBP-H)。干預(yù)組采取腹腔給藥。采用神經(jīng)元順行示蹤劑(Biotin dextran amine,BDA)研究NBP對皮層組織神經(jīng)軸突生長(axonl sprouting)的影響。采用高爾基染色法(Golgi-stain)觀察NBP對樹突和樹突棘的影響。結(jié)果:1采用Rotarod評價(jià)小鼠神經(jīng)功能行為學(xué)。手術(shù)分為急性期和慢性期兩組。急性期和慢性期的Vehicle組、NBP小劑量(20mg/kg)組(NBP-L)、及NBP大劑量(40 mg/kg)組(NBP-H)小鼠均出現(xiàn)不同程度的左側(cè)肢體偏癱。急性期時(shí):NBP小劑量組與溶劑對照組比較發(fā)現(xiàn)術(shù)后第4天,5天,7天,8天,9天,14天,15天,16天有差異,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Vehicle vs.NBP-L:4天:38.37±3.53 vs.51.14±3.31,P0.05;5天:43.74±3.34 vs.56.67±3.96,P0.05;7天:44.48±2.69 vs.66.16±4.39,P0.05;8天:44.42±2.28 vs.63.41±3.68,P0.05;9天:39.24±2.95 vs.69.94±5.14,P0.05;14天:38.97±4.33 vs.57.24±3.92,P0.05;15天:36.25±4.16 vs.50.62±4.28,P0.05;16天:33.19±5.27 vs.51.14±5.22,P0.05)。大劑量組與溶劑對照組比較發(fā)現(xiàn)術(shù)后第4天,5天,7天,9天,14天有差異,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Vehicle vs.NBP-H:4天:38.37±3.53 vs.48.51±3.52,P0.05;5天:43.74±3.34 vs.55.32±3.93,P0.05;7天:44.48±2.69 vs.66.37±4.87,P0.05;9天:39.24±2.95 vs.69.94±5.14,P0.05;14天:38.97±4.33 vs.56.73±4.93,P0.05)。慢性期時(shí):NBP小劑量組與溶劑對照組比較發(fā)現(xiàn)術(shù)后第14天,15天,16天,28天,29天,30天有差異,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Vehicle vs.NBP-L:14天:22.30±1.55 vs.31.45±2.34,P0.05;15天:31.42±2.07 vs.42.28±2.56,P0.05;16天:28.88±2.28 vs.39.11±2.30,P0.05;28天:31.24±2.65 vs.41.61±2.37,P0.05;29天:31.66±2.73 vs.42.60±2.57,P0.05;30天:31.94±2.89 vs.52.70±3.29,P0.05)而慢性期NBP大劑量組與溶劑對照組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2免疫組化法和免疫熒光共聚焦技術(shù)檢測到GAP43在腦梗死后可以表達(dá)。3 NBP對Shh/Ptch1/Gli1通路及GAP43和BDNF表達(dá)的影響:NBP低劑量組NBP-L與溶劑對照組相比,Gli1在3天,7天蛋白水平的表達(dá)明顯增高(P0.05),Ptch在7天,14天蛋白水平的表達(dá)明顯增高(P0.05),Shh在14天的時(shí)候蛋白水平的表達(dá)明顯增高(P0.05),BDNF在3天,14天蛋白水平的表達(dá)明顯增高(P0.05);Ptch1在14天蛋白水平的表達(dá)明顯增高(P0.05),BDNF在3天,14天蛋白水平的表達(dá)明顯增高(P0.05)。GAP43總蛋白與溶劑對照組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外在測量低劑量組NBP-L和高劑量組NBP-H胞漿蛋白中發(fā)現(xiàn)Gli1在14天和28天與溶劑對照組相比蛋白水平的表達(dá)明顯增高(P0.05)。4高爾基染色發(fā)現(xiàn)NBP-L組較溶劑對照組在樹突和樹突棘的數(shù)量和形態(tài)上有明顯變化。神經(jīng)順行示蹤劑發(fā)現(xiàn)NBP-L組較溶劑對照組在軸突再生上有明顯變化。結(jié)論:給予NBP進(jìn)行腦梗死干預(yù)后,低劑量組改善神經(jīng)功能行為學(xué)評分的效果更加明顯;進(jìn)一步的研究表明NBP上調(diào)了Shh/Ptch1/Gli1和BDNF表達(dá)水平,對腦缺血后腦組織神經(jīng)可塑性具有保護(hù)作用,為NBP臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：腦梗死 神經(jīng)功能恢復(fù) 神經(jīng)可塑性 正丁基苯酞 Shh信號通路 BDNF GAP43
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-25
• 結(jié)果25-27
• 附圖27-33
• 討論33-36
• 結(jié)論36
• 參考文獻(xiàn)36-39
• 綜述 神經(jīng)可塑性在腦梗死后神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)的研究39-49
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 致謝49-50
• 個(gè)人簡歷50

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本文編號：387556