本文關(guān)鍵詞：自噬介導(dǎo)的α-突觸核蛋白降解在GM1緩解MPTP所致的帕金森病中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的:帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是多發(fā)于中老年人的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,主要的病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的損傷和神經(jīng)元內(nèi)路易小體的出現(xiàn)。多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的損傷是臨床診斷和治療帕金森病患者的重要依據(jù),目前藥物治療的靶點(diǎn)也多數(shù)圍繞恢復(fù)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的水平,如抑制單胺氧化酶B、激動(dòng)多巴胺受體和抑制膽堿能神經(jīng)等;但基于改善多巴胺水平的臨床治療藥物并不能徹底治愈帕金森病,另一方面,針對(duì)降解或清除路易小體的藥物還處于研究階段。異常聚集的α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)是路易小體的最主要成分,此蛋白在神經(jīng)元內(nèi)能夠調(diào)節(jié)突觸囊泡的循環(huán)、多巴胺的釋放、酪氨酸羥化酶(TH)的活性等,因此清除異常聚集的α-syn可能是治療帕金森病的潛在靶點(diǎn)。神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)是臨床用于治療帕金森病的藥物。動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)都證明GM1具有緩解帕金森病癥狀的效果,能夠修復(fù)受損的神經(jīng)元;但其具體的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。本實(shí)驗(yàn)旨在探索GM1保護(hù)MPTP誘導(dǎo)的帕金森病損傷的作用機(jī)制。研究方法:(1)在動(dòng)物水平上評(píng)價(jià)GM1抗PD的藥效,同時(shí)觀察GM1與自噬的關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)使用C57BL/6小鼠,分組情況為:空白對(duì)照組、GM1高劑量組(GM1-H)、MPTP模型組、MPTP+GM1低劑量組(MPTP+GM1-L)、MPTP+GM1高劑量組(MPTP+GM1-H)、MPTP+3-MA+GM1高劑量組(MPTP+GM1-H+3-MA)和MPTP+司來(lái)吉蘭組(MPTP+Sele),每組15只。除空白對(duì)照組和GM1高劑量組,其他小鼠腹腔注射MPTP(30 mg/kg/d),連續(xù)注射5天,建立帕金森病的亞急性動(dòng)物模型。MPTP造模5天后,根據(jù)組別連續(xù)兩周給予相應(yīng)的GM1、3-MA和Sele,空白對(duì)照組和MPTP組給予相應(yīng)的生理鹽水。GM1給藥方式為腹腔注射,低劑量為25 mg/kg/d,高劑量為50 mg/kg/d;3-MA給藥方式為腹腔注射,于GM1給藥前30分鐘先注射,劑量15 mg/kg/d;Sele給藥方式灌胃,劑量為60 mg/kg/d。給藥結(jié)束后對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià),包括爬桿實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和Cat Walk步態(tài)分析,分別檢測(cè)小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。(2)在細(xì)胞水平上探索GM1抗PD的作用機(jī)制用MPTP的活性代謝產(chǎn)物MPP+造成SH-SY5Y細(xì)胞的帕金森病損傷模型。然后在MPP+損傷基礎(chǔ)上給予一系列濃度GM1(去掉含有MPP+的培養(yǎng)液,加入含有GM1的培養(yǎng)液),觀察其對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,最終選擇40μM GM1作用24小時(shí)。使用顯微鏡觀察GM1對(duì)MPP+作用后細(xì)胞形態(tài)的影響,采用Western Blot檢測(cè)GM1對(duì)PD模型細(xì)胞α-syn和酪氨酸羥化酶(TH)水平的影響,同時(shí)觀察GM1對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3I向LC3II轉(zhuǎn)化作用的影響。采用Western Blot和激光共聚焦顯微鏡觀察GM1對(duì)正常SH-SY5Y細(xì)胞自噬量的影響。最后采用激光共聚焦顯微鏡觀察α-syn和LC3標(biāo)記的自噬小體的共定位,以探索GM1與自噬介導(dǎo)的α-syn清除的關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果:(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MPTP模型組與對(duì)照組在爬桿實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和Cat Walk步態(tài)分析方面都顯示出差異;陽(yáng)性藥司來(lái)吉蘭(Sele)組與模型組相比,小鼠運(yùn)動(dòng)能力得到明顯恢復(fù)。MPTP+GM1-L和MPTP+GM1-H與MPTP組相比,行為學(xué)數(shù)據(jù)均有明顯改善,表現(xiàn)為小鼠爬至桿底所用時(shí)間較MPTP組顯著減少,在轉(zhuǎn)動(dòng)的滾輪上持續(xù)跑動(dòng)的時(shí)間明顯增加,步態(tài)分析檢測(cè)顯示MPTP+GM1-L和MPTP+GM1-H組小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡規(guī)律性更加明顯,速度顯著提高,步頻增加,速度更加穩(wěn)定。而MPTP+GM1-H+3-MA組與MPTP+GM1-H相比,小鼠的運(yùn)動(dòng)能力的恢復(fù)又被逆轉(zhuǎn)。GM1-H組小鼠的行為學(xué)指標(biāo)均與空白對(duì)照組沒(méi)有差異。(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,顯微鏡下觀察PD模型組細(xì)胞變得細(xì)長(zhǎng),內(nèi)部出現(xiàn)空泡;給予40μM GM1后,細(xì)胞形態(tài)得到改善。Western Blot分析檢測(cè)蛋白水平,發(fā)現(xiàn)GM1能夠明顯增加TH的水平,減少單體α-syn的水平。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),同自噬促進(jìn)劑和抑制劑相比,GM1能夠增加自噬標(biāo)記蛋白LC3II與LC3I的比例。GM1在濃度40μM和作用24小時(shí)時(shí)能最大程度促進(jìn)正常SH-SY5Y細(xì)胞自噬量。串聯(lián)的熒光蛋白標(biāo)記LC3,發(fā)現(xiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)至24 h,GM1使綠色和紅色熒光蛋白的共定位明顯增加,紅色熒光蛋白也明顯增加。共聚焦顯微鏡下,發(fā)現(xiàn)GM1能夠增加α-syn和LC3標(biāo)記的自噬小體的共定位。結(jié)論:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明GM1能夠緩解MPTP誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠帕金森病的癥狀;細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示GM1能夠增加SH-SY5Y細(xì)胞的自噬水平,促進(jìn)自噬介導(dǎo)的α-syn的清除。
【關(guān)鍵詞】：神經(jīng)節(jié)苷脂 帕金森病 MPTP 自噬 α-突觸核蛋白
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R742.5
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-9
• 英文縮略詞表9-12
• 第一章 前言12-26
• 第一節(jié) 帕金森病與 α-突觸核蛋白的關(guān)系12-20
• 1.1 帕金森病的致病因素及病理假說(shuō)12-15
• 1.2 α-突觸核蛋白的功能和結(jié)構(gòu)15-17
• 1.3 α-突觸核蛋白在帕金森病中的研究進(jìn)展17-20
• 第二節(jié) 自噬與帕金森病20-22
• 2.1 自噬的概念與分類(lèi)20
• 2.2 自噬在帕金森病中的研究進(jìn)展20-22
• 第三節(jié) GM1 與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究進(jìn)展22-24
• 3.1 GM1 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生理作用22-23
• 3.2 GM1 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用研究23-24
• 第四節(jié) 立題依據(jù)和研究?jī)?nèi)容24-26
• 第二章 GM1 對(duì)MPTP誘導(dǎo)的帕金森病模型小鼠的保護(hù)作用研究26-46
• 第一節(jié) GM1 對(duì)帕金森病模型小鼠行為學(xué)的改善作用26-44
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料26-28
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法28-30
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-44
• 第二節(jié) 本章小結(jié)與討論44-46
• 第三章 GM1對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞帕金森病模型的保護(hù)作用和機(jī)制研究46-67
• 第一節(jié) GM1 對(duì)MPP+誘導(dǎo)的帕金森病模型細(xì)胞的保護(hù)作用46-54
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料46-47
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法47-50
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-54
• 第二節(jié) GM1 緩解MPP+損傷SH-SY5Y細(xì)胞的機(jī)制研究54-65
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料54-55
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法55-58
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-65
• 第三節(jié) 本章小結(jié)與討論65-67
• 總結(jié)與展望67-69
• 參考文獻(xiàn)69-82
• 致謝82-84
• 在校期間發(fā)表論文84

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：387127