本文關(guān)鍵詞：硫化氫通過AMPK激活調(diào)控腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的:硫化氫(H2S)是重要的內(nèi)源性氣體信號分子。本課題組研究表明在LPS導(dǎo)致的中樞神經(jīng)炎癥模型中H2S通過AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶)激活選擇性誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞另類(M2)極化。我們還發(fā)現(xiàn)H2S供體在動物模型中抑制腦缺血后過度的中樞神經(jīng)炎癥,但分子機制尚不明確�；谇捌谘芯�,本課題的目的是探討硫化氫是否在腦缺血后通過AMPK活化促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化,進(jìn)而促進(jìn)抑制樞神經(jīng)炎癥并腦缺血后血管新生。研究方法:收集神經(jīng)元缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)處理后的細(xì)胞培養(yǎng)上清,以此條件上清處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞和原代小膠質(zhì)細(xì)胞模擬體內(nèi)腦缺血激活小膠質(zhì)細(xì)胞的體外模型;應(yīng)用小鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)法建立動物缺血性腦卒中模型。利用緩釋H2S供體(ADT-OH)和過表達(dá)胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase,CBS)的方法研究H2S選擇性誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化的機制。應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測AMPK活化(磷酸化)、CBS以及胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的表達(dá);通過實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,Q-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)技術(shù)檢測M1(促炎狀態(tài))/M2(抗炎狀態(tài))細(xì)胞因子的表達(dá)變化;應(yīng)用AMPK和Ca MKKβ抑制劑以及si RNA技術(shù)探索H2S促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化是否依賴于AMPK及Ca MKKβ;利用腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(b End3)在基質(zhì)膠上形成血管狀結(jié)構(gòu)的能力探討在條件上清處理時ADT-OH是否通過小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化促進(jìn)血管新生。在動物水平上,通過小鼠MCAO模型驗證H2S供體對AMPK活化和M1/M2細(xì)胞代表因子的表達(dá)的影響。結(jié)果:在神經(jīng)元缺氧缺糖條件上清處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞或原代小膠質(zhì)細(xì)胞建立的腦缺血激活小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞模型中,Western Blot結(jié)果顯示:與溶劑對照組(Con)和正常神經(jīng)元培養(yǎng)基(Neuron Condition medium,Neuron CM)處理的對照組相比,經(jīng)缺氧缺糖神經(jīng)元條件上清處理(OGD Neuron Condition Medium,OGD Neuron CM)的小膠質(zhì)細(xì)胞AMPK活化水平明顯降低(P0.05),而ADT-OH在OGD Neuron CM處理時顯著提高小膠質(zhì)細(xì)胞AMPK活化水平(P0.05)。Q-PCR/ELISA結(jié)果顯示:OGD Neuron CM導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化代表因子(i NOS,IL-1β,IL-6,TNF-α)表達(dá)明顯升高(P0.05);ADT-OH則下調(diào)OGD Neuron CM誘導(dǎo)的M1極化代表因子的表達(dá)、并顯著上調(diào)OGD Neuron CM抑制的M2極化代表因子(ARG,YM1/2,IL-10)的表達(dá)(P0.05)。這些結(jié)果表明,OGD Neuron CM導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化,ADT-OH在OGD Neuron CM處理時促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2狀態(tài)轉(zhuǎn)化。利用神經(jīng)元條件上清刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后檢測CBS和CSE的表達(dá),Western Blot和Q-PCR結(jié)果均顯示:與溶劑對照組(Con)和正常神經(jīng)元培養(yǎng)基(Neuron Condition medium,Neuron CM)處理的對照組相比,經(jīng)缺氧缺糖神經(jīng)元條件上清處理(OGD Neuron Condition Medium,OGD Neuron CM)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞CBS表達(dá)水平明顯降低(P0.05),CSE表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。在BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)CBS或轉(zhuǎn)染Vector(對照),無論是否存在OGD Neuron CM刺激,與轉(zhuǎn)染Vector組的BV2細(xì)胞相比,過表達(dá)CBS的BV2細(xì)胞組AMPK活化水平均顯著升高,同時CBS過表達(dá)組在OGD Neuron CM處理時明顯促進(jìn)BV2細(xì)胞向M2活化狀態(tài)轉(zhuǎn)化(P0.05)。此外,AMPK抑制劑和AMPK si RNA以及Ca MKKβ抑制劑均抑制ADT-OH對BV2細(xì)胞向M2狀態(tài)轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用(P0.05)。以上實驗結(jié)果說明,ADT-OH通過促進(jìn)AMPK活化而促使BV2細(xì)胞向M2狀態(tài)轉(zhuǎn)化。應(yīng)用腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(b End3)研究ADT-OH通過小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化對促進(jìn)血管新生的作用。OGD Neuron CM和ADT-OH同時處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24h后獲得的條件培養(yǎng)液(OGD Neuron CM+ADT-OH)促進(jìn)b End3細(xì)胞在基質(zhì)膠上形成血管狀結(jié)構(gòu),而OGD Neuron CM或Neuron CM處理BV2細(xì)胞后獲得的條件培養(yǎng)液、以及正常BV2細(xì)胞培養(yǎng)液均不能促進(jìn)b End3細(xì)胞在基質(zhì)膠上形成血管狀結(jié)構(gòu)。利用BV2細(xì)胞轉(zhuǎn)染AMPK si RNA或NC si RNA(對照)研究AMPK對血管新生的影響,結(jié)果顯示:與NC si RNA(對照)相比,OGD Neuron CM和ADT-OH共處理轉(zhuǎn)染si AMPK的BV2細(xì)胞后獲得的條件培養(yǎng)液(OGD Neuron CM+ADT-OH+si AMPK)不能促進(jìn)b End3細(xì)胞形成血管狀結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果表明:經(jīng)神經(jīng)元條件上清處理后ADT-OH通過AMPK介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化機制促進(jìn)血管的新生。在小鼠腦缺血模型中,ADT-OH能夠促進(jìn)皮層組織中AMPK的活化(P0.05),抑制M1細(xì)胞代表因子的表達(dá)并且上調(diào)M2細(xì)胞代表因子的表達(dá)(P0.05)。在動物水平上表明了H2S可能通過活化AMK抑制缺血性神經(jīng)炎癥。結(jié)論與創(chuàng)新:我們首次表明H2S通過AMPK介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化機制在腦缺血后調(diào)控中樞炎癥應(yīng)答并促進(jìn)血管新生。
【關(guān)鍵詞】：腦缺血 硫化氫 缺氧缺糖模型 小膠質(zhì)細(xì)胞 5-對羥基苯基-1 2-二硫雜環(huán)戊烯-3-硫酮(ADT-OH)
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 引言10-12
• 實驗材料12-19
• 1.1 細(xì)胞12
• 1.2 動物12
• 1.3 藥品及試劑12-13
• 1.4 抗體及儀器13-14
• 1.5 試劑制備14-19
• 實驗方法19-29
• 2.1 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞系培養(yǎng)19
• 2.2 原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)19-20
• 2.3 原代神經(jīng)元的培養(yǎng)20-21
• 2.4 體外神經(jīng)元缺氧、缺糖（OXYGEN-GLUCOSE DEPRIVATION,OGD）模型的建立21
• 2.5 MTT法檢測BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞和原代小膠質(zhì)細(xì)胞存活率21
• 2.6 CBS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)實驗21-22
• 2.7 CBS/VECTOR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：22-23
• 2.8 SIRNA干擾敲除AMPK基因（按試劑盒說明書操作）23
• 2.9 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BEND3）系和體外血管新生23
• 2.10 WESTERN BLOT23-24
• 2.11 實時熒光定量PCR（REAL-TIME QUANTITATIVE PCR, Q-PCR）24-27
• 2.12 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）：IL-10 含量檢測（按照試劑盒說明書操作）27
• 2.13 大腦中動脈阻塞模型（MCAO模型）27-28
• 2.14 統(tǒng)計學(xué)方法28-29
• 實驗結(jié)果29-53
• 討論53-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 綜述61-69
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 英文縮略詞表69-70
• 致謝70-71

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1 李娟娟;凌文華;;AMPK與肥胖[J];國際內(nèi)科學(xué)雜志;2007年11期

2 劉文倩;艾華;;AMPK與肥胖和減肥關(guān)系研究進(jìn)展[J];中國運動醫(yī)學(xué)雜志;2008年06期

3 蔡明春,黃慶愿,高鈺琪;AMPK與能量代謝[J];重慶醫(yī)學(xué);2005年01期

4 葛斌;謝梅林;顧振綸;周文軒;郭次儀;;AMPK作為治療2型糖尿病新靶點的研究進(jìn)展[J];中國藥理學(xué)通報;2008年05期

5 徐靜;劉毅;完強;賈振華;王榮;;高糖環(huán)境對大鼠腎小球系膜細(xì)胞AMPK表達(dá)及活性的影響[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2009年05期

6 宮克城;丁樹哲;;AMPK與2型糖尿病的關(guān)系及其在運動介導(dǎo)下的研究[J];遼寧體育科技;2009年03期

7 羅招凡;李芳萍;丁鶴林;程樺;;AMPKα2基因克隆及其野生型和突變型真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年28期

8 丁曉潔;王佑民;王麗萍;;高脂飲食對大鼠肝臟組織AMPK表達(dá)及其活性的影響[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2009年06期

9 程媛;王佑民;丁曉潔;;肥胖大鼠骨骼肌AMPK表達(dá)及其與糖脂代謝的關(guān)系[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2010年02期

10 黃德強;羅凌玉;王麗麗;羅時文;呂農(nóng)華;羅志軍;;AMPK在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報;2011年11期

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1 ;Co-commitment and Interplay between Akt and AMPK in the Regulation of Endothelial NO Synthase Phosphorylation by Reactive Oxygen Species[A];第九屆全國心血管藥理學(xué)術(shù)會議論文集[C];2007年

2 Paul M Vanhoutte;;SIRT1 and AMPK:the Seesaw Effect in Regulating Endothelial Sene-scence[A];第八屆海峽兩岸心血管科學(xué)研討會論文集[C];2011年

3 李瑾;朱海波;;新結(jié)構(gòu)類型調(diào)血脂化合物與靶蛋白AMPK分子間相互作用初步解析[A];全國第十二屆生化與分子藥理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

4 宋海燕;李強;孫玉倩;張巾超;鄔艷慧;;AMPK結(jié)合蛋白的篩選及其與2型糖尿病的關(guān)系研究[A];2008內(nèi)分泌代謝性疾病系列研討會暨中青年英文論壇論文匯編[C];2008年

5 ;AMPK mediated an apoptotic response to combined effect of hypoxia stress and ER stress[A];2012全國發(fā)育生物學(xué)大會摘要集[C];2012年

6 ZHANG Jian-wei;MA Xiao-wei;DENG Rui-fen;DING Shan;GU Nan;GUO Xiao-hui;;Genetic variability in AMPKαl gene may have synergetic effect with smoking on risk of coronary artery disease in chinese type 2 diabetics[A];中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會第十六次全國學(xué)術(shù)會議論文集[C];2012年

7 姚遠(yuǎn);周京軍;裴建明;;AMPK介導(dǎo)無鈣預(yù)處理心肌保護作用[A];中國生理學(xué)會第九屆全國青年生理學(xué)工作者學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2011年

8 季樂樂;Haifeng Zhang;Feng Gao;;A novel mechanism of preconditioning:Attenuating reperfusion injury through enhanced myocardial glucose uptake via insulin-stimulated Akt and AMPK activation[A];中國生理學(xué)會第十屆全國青年生理學(xué)工作者學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2013年

9 WU Qiao;;The orphan nuclear receptor Nur77 regulates AMPK activity through LKB1 subcellular localization in glucose metabolism[A];細(xì)胞—生命的基礎(chǔ)——中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會2013年全國學(xué)術(shù)大會·武漢論文摘要集[C];2013年

10 Jia-Wei Wu;;Conserved elements in allosteric regulation of AMPK[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第十一次會員代表大會暨2014年全國學(xué)術(shù)會議論文集——專題報告二[C];2014年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 黃敏;精力充沛基因決定?[N];新華每日電訊;2011年

2 實習(xí)生 程鳳;不愛鍛煉可能與基因缺失有關(guān)[N];科技日報;2011年

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1 陳雷;AMP激活的蛋白質(zhì)激酶（AMPK）調(diào)控機制的研究[D];清華大學(xué);2010年

2 張秀娟;TSH調(diào)節(jié)肝臟HMG-CoA還原酶磷酸化修飾的研究[D];山東大學(xué);2014年

3 趙順玉;消積飲聯(lián)合CIK通過AMPKα/Sp1/EZH2/DNMT1相關(guān)通路抗肺癌生長的作用機制[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2015年

4 王紅亮;AMPK-α在鹵蟲胚胎發(fā)育過程中對細(xì)胞有絲分裂調(diào)控的研究[D];浙江大學(xué);2015年

5 周錫紅;三甲基甘氨酸通過AMPK途徑影響脂肪沉積的研究[D];浙江大學(xué);2015年

6 朱莉;電鏡單顆粒技術(shù)研究全長AMPK蛋白的構(gòu)架及變構(gòu)效應(yīng)[D];蘭州大學(xué);2011年

7 符慶瑛;大腸桿菌雙雜交篩選AMPKα2相互作用蛋白[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

8 鄧虎平;燙傷大鼠骨骼肌AMPK的活化對蛋白分解的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2010年

9 余冰;AMPK對應(yīng)激狀態(tài)下仔豬脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

10 梁俊芳;AMPKα亞基對小鼠骨骼肌生長發(fā)育及宰后糖酵解過程的影響[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

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1 柯志強;AMPK信號通路在白藜蘆醇改善高糖誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞損傷中的作用[D];湖北科技學(xué)院;2015年

2 肖瑤;AMPK對低氧誘導(dǎo)血管生成作用的研究[D];湖北科技學(xué)院;2015年

3 王玉兵;HIF-1α、AMPK、E-cadherin在前列腺癌組織中的表達(dá)及意義[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

4 魏蘇玉;乙醇對H4-ⅡE細(xì)胞脂質(zhì)代謝及AMPK表達(dá)的影響[D];延邊大學(xué);2015年

5 陳婷;肌肉特異敲除AMPKα2對小鼠脂代謝的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

6 張二東;銅離子及模擬太空環(huán)境通過ROS/AMPK信號誘導(dǎo)人B淋巴母細(xì)胞凋亡[D];蘭州大學(xué);2015年

7 徐英秀;硫化氫通過AMPK激活調(diào)控腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞的極化狀態(tài)[D];蘇州大學(xué);2015年

8 黃艷;AMPK和SIRT-1參與定時高脂飲食對小鼠肝臟生物鐘基因的影響研究[D];蘇州大學(xué);2015年

9 楊霞;AMPK參與線粒體通路介導(dǎo)的氟致H9c2心肌細(xì)胞凋亡機制的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

10 閆旭紅;胰島素對1型糖尿病大鼠睪丸脂聯(lián)素及其受體、AMPK、AKT和eNOS表達(dá)的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

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