發(fā)布時(shí)間：2017-05-22 08:53

  本文關(guān)鍵詞：基于微流控芯片平臺(tái)解析缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化的內(nèi)皮細(xì)胞增強(qiáng)膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞抵抗替莫唑胺的機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分:缺氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞向血管內(nèi)皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。目的:通過體外缺氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞(glioma stem-like cell,GSLC)轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞(glioma derived endothelial cell,GDEC),同時(shí)進(jìn)一步檢測膠該細(xì)胞在體外培養(yǎng)的性質(zhì)和功能變化特點(diǎn)。方法:體外通過RFP+的SU3膠質(zhì)瘤細(xì)胞系,通過無血清培養(yǎng)GSLC,后將GSLC在特定的轉(zhuǎn)分化的培養(yǎng)基中,置于缺氧小室內(nèi)進(jìn)行缺氧(1.5%O2)培養(yǎng)48h。以培養(yǎng)HBMEC作為對照,觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;利用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)對該細(xì)胞進(jìn)行CD31和v WF內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物聯(lián)合鑒定;通過Matrigel膠上進(jìn)行三維培養(yǎng),進(jìn)一步考察該細(xì)胞形成血管管腔樣結(jié)構(gòu)的功能,同時(shí)應(yīng)用透射電鏡對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,比較該細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的差異;最后通過無血清培養(yǎng)探討GDEC向GSLC逆向分化現(xiàn)象,以及明確在共同培養(yǎng)基中培養(yǎng),檢測內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的變化情況。結(jié)果:1)缺氧條件下在轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)GSLC48h,形態(tài)學(xué)上細(xì)胞分布由雜亂無章逐漸形成規(guī)則鋪路分布,細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成梭形內(nèi)皮細(xì)胞樣結(jié)構(gòu),同時(shí)能夠陽性表達(dá)CD31及v WF內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物。2)GDEC具備正常內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì),在Matrigel膠上能夠形成典型血管腔樣結(jié)構(gòu);與正常內(nèi)皮細(xì)胞相比,GDEC具備更豐富的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。3)轉(zhuǎn)分化血管內(nèi)皮細(xì)胞仍保留腫瘤細(xì)胞性質(zhì),在無血清培養(yǎng)下能較快逆分化成GSLC,而在含有內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中則能長時(shí)間維持內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)論:體外缺氧條件下,GSLC在轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基中能夠分化為具有內(nèi)皮細(xì)胞性質(zhì)和功能的血管內(nèi)皮樣細(xì)胞,它保留部分腫瘤細(xì)胞的性質(zhì),在不同培養(yǎng)條件下,能轉(zhuǎn)變成不同類型的細(xì)胞。第二部分:基于腫瘤缺氧niche理念構(gòu)建膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的在線分析模型目的:基于腫瘤組織缺氧niche理念,體外構(gòu)建在缺氧條件下GSLC與內(nèi)皮細(xì)胞之間相互作用在線分析模型,并探討GDEC對GSLC作用。方法:結(jié)合HE和免疫熒光雙染技術(shù),證實(shí)腦膠質(zhì)瘤組織缺氧區(qū)血管旁微環(huán)境的存在�；谙嚓P(guān)病理參數(shù)基礎(chǔ)上,利用PDMS通過“光刻法”制作微流控芯片,通過疊加組裝形成上下層各有3條“L”型通道的微流控芯片,結(jié)合缺氧小室構(gòu)建缺氧共培養(yǎng)系統(tǒng)。通過熒光報(bào)告系統(tǒng)和氧電極實(shí)時(shí)記錄細(xì)胞相互作用的距離和氧氣含量變化。應(yīng)用死活試劑分析系統(tǒng)中GSLC、HBMEC、GDEC培養(yǎng)24h、48h、72h的存活情況;通過細(xì)胞熒光蛋白和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)追蹤該系統(tǒng)中培養(yǎng)48h的GSLC、HBMEC、GDEC細(xì)胞原有標(biāo)記物的變化;最后結(jié)合細(xì)胞熒光蛋白標(biāo)記和細(xì)胞熒光追蹤技術(shù),將各種內(nèi)皮細(xì)胞和GSLC接種在芯片上下層通道內(nèi),構(gòu)建單獨(dú)培養(yǎng)GSLC、HBMEC和GSLC共培養(yǎng)以及GDEC和GSLC共培養(yǎng)的三組在線分析模型,以前面兩組作為對照組,分析缺氧環(huán)境中在GDEC作用下,GSLC細(xì)胞增殖情況。結(jié)果:1)缺氧小室和微流控芯片構(gòu)建的缺氧共培養(yǎng)系統(tǒng)提供更靠近真實(shí)腫瘤微環(huán)境內(nèi)皮細(xì)胞與GSLCs相互作用的平臺(tái)。2)GSLC、HBMEC、GDEC缺氧共培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)24h、48h、72h呈現(xiàn)良好生長,利用選取培養(yǎng)48h以上各種細(xì)胞進(jìn)行原有細(xì)胞標(biāo)記物在線檢測,結(jié)果表明以上各種細(xì)胞的原有標(biāo)記物呈現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)3)通過細(xì)胞熒光蛋白標(biāo)記和細(xì)胞熒光追蹤技術(shù)在線分析表明在缺氧共培養(yǎng)系統(tǒng)中GDEC具有更強(qiáng)促進(jìn)GSLC增殖作用。結(jié)論:雙層微流控芯片結(jié)合缺氧小室構(gòu)成的缺氧共培養(yǎng)系統(tǒng)可有效應(yīng)用于缺氧環(huán)境下細(xì)胞之間相互作用的研究,并成功模擬并證實(shí)缺氧下GDEC和GSLC之間的串話;同時(shí)結(jié)合細(xì)胞熒光蛋白標(biāo)記和熒光追蹤技術(shù)實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞實(shí)時(shí)觀察檢測的功能。第三部分:缺氧下誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的內(nèi)皮細(xì)胞對膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞抵抗替莫唑胺的影響及分子機(jī)制目的:探索缺氧微環(huán)境中GDEC對GSLC抵抗TMZ作用的影響及分子機(jī)制方法:基于第二部實(shí)驗(yàn)搭建缺氧共培養(yǎng)在線分析模型的基礎(chǔ)上,構(gòu)建單獨(dú)培養(yǎng)GSLC、HBMEC和GSLC共培養(yǎng)以及GDEC和GSLC共培養(yǎng)三組化療共培養(yǎng)模型,在各組實(shí)驗(yàn)中添加2000μmmol/L的TMZ作用48h,以前兩組作為對照組,每組設(shè)3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn),通過激光共聚焦技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)分析在GDEC細(xì)胞作用下,GSLC存活和凋亡比例;最后在未加藥的三組共培養(yǎng)模型中,通過Western-blot以及免疫熒光技術(shù)分析Jagged1、DLL4在與GSLC共培養(yǎng)前后GDEC表達(dá)情況,同時(shí)Elisa法檢測三組共培養(yǎng)體系中共同培養(yǎng)基中Jagged1和DLL4含量;結(jié)合熒光定量PCR分析在GDEC作用下,GSLC細(xì)胞Notch信號下游Hes1激活情況。結(jié)果:1)缺氧共培養(yǎng)系統(tǒng)中三組實(shí)驗(yàn),進(jìn)行TMZ藥物干預(yù)48h,有內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)下,GSLC的存活比例高,凋亡細(xì)胞少;其中,在GDEC作用下,GSLC存活比例最高,凋亡細(xì)胞最少。2)與GSLC缺氧共培養(yǎng)48h后,通過橫向?qū)Ρ萕estern-blot以及免疫熒光結(jié)果,表明GDEC細(xì)胞表達(dá)更高的Jagged1和DLL4配體;同時(shí)通過縱向?qū)Ρ扰cGSLC共培養(yǎng)前后,GDEC細(xì)胞上Jagged1/DLL4蛋白表達(dá)上調(diào)。Elisa結(jié)果表明在與GDEC共培養(yǎng)共同培養(yǎng)基中的Jagged1和DLL4濃度含量最高。熒光定量PCR結(jié)果證實(shí)了在GDEC共培養(yǎng)下,GSLC細(xì)胞Notch下游基因Hes1上調(diào)表達(dá)最為明顯。結(jié)論:缺氧微環(huán)境中,GDEC能夠表達(dá)和分泌更高Notch配體(Jagged1、DLL4),激活更強(qiáng)的Notch信號通路,有效促進(jìn)GSL增殖以及對TMZ抵抗。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)分化 腫瘤干細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞 缺氧 微流控 缺氧微環(huán)境 膠質(zhì)瘤 增殖 Notch 內(nèi)皮細(xì)胞 腫瘤干細(xì)胞 耐藥
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.4
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 第一部分: 缺氧誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞向血管內(nèi)皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化12-30
• 前言12-14
• 材料和方法14-23
• 1. 基本材料和主要試劑14-15
• 2. 主要儀器15
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法15-23
• 結(jié)果23-28
• 1. 膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的形態(tài)學(xué)變化23-24
• 2. GSLC 轉(zhuǎn)分化為 GDEC 過程中細(xì)胞表面標(biāo)記物變化。24-25
• 3. GSLC 轉(zhuǎn)分化的內(nèi)皮細(xì)胞（GDEC）內(nèi)皮行為及超微結(jié)構(gòu)。25-26
• 4. 體外 GSLC 轉(zhuǎn)分化的內(nèi)皮細(xì)胞（GDEC）在不同培養(yǎng)基中標(biāo)記物變化26-28
• 討論28-30
• 第二部分: 基于腫瘤缺氧niche理念構(gòu)建膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的在線分析模型30-56
• 前言30-32
• 材料和方法32-42
• 1. 基本材料和主要試劑32
• 2. 主要儀器32
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法32-42
• 結(jié)果42-53
• 1 雙層微流控芯片配合缺氧小室體外缺氧共培養(yǎng)裝置的搭建42-53
• 討論53-56
• 第三部分：缺氧下誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的內(nèi)皮細(xì)胞對膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞抵抗替莫唑胺的影響及分子機(jī)制56-83
• 前言56-58
• 材料和方法58-73
• 1. 主要試劑與材料58-59
• 2. 實(shí)驗(yàn)儀器59
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法59-73
• 結(jié)果73-81
• 1. GDEC 比 HBMEC 表現(xiàn)更強(qiáng)促進(jìn) GSLC 抵抗 TMZ 作用能力。73-75
• 2. Notch 信號配體 Jagged1 和 DLL4 在膠質(zhì)瘤組織缺氧區(qū)的表達(dá)75-76
• 3. 與GSLC缺氧共培養(yǎng)前后，GDEC細(xì)胞上 Notch信號配體Jagged1及 DLL4 的表達(dá)。76-79
• 4. 與GSLC缺氧共培養(yǎng)前后，GDEC細(xì)胞上Notch信號配體Jagged1及 DLL4 的分泌情況。79-80
• 5. 與 GDEC 細(xì)胞缺氧共培養(yǎng)后，GSLC 細(xì)胞 Hes1 基因的表達(dá)。80-81
• 討論81-83
• 結(jié)論83-84
• 參考文獻(xiàn)84-88
• 綜述88-92
• 參考文獻(xiàn)91-92
• 個(gè)人簡介與完成的學(xué)術(shù)論文92-93
• 致謝93

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本文編號：385172