本文關鍵詞：mTOR通路通過CD44促進神經(jīng)元再生的內在機制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：神經(jīng)損傷類疾病的治療一直是困擾醫(yī)學界的一大難題。目前，治療神經(jīng)損傷類疾病的方法大體包括細胞的替代治療和改善神經(jīng)受損后局部抑制性的微環(huán)境兩個方面。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元損傷后再生失敗的原因錯綜復雜，上述治療手段的效果往往不能從根本上解決問題。因此，闡明神經(jīng)元內在再生能力的機制，探究神經(jīng)損傷軸突再生的相關通路仍然是神經(jīng)損傷類疾病治療的關鍵。本實驗通過體外誘導SH-SY5Y細胞分化，使其具有成熟神經(jīng)元的特征，從而用作本研究的體外神經(jīng)細胞模型。通過用RNA干擾技術下調分化SH-SY5Y細胞中PTEN基因表達，從而使mTOR通路激活，檢測相關CD44分子表達是否上調及其與軸突生長的內部聯(lián)系，進一步探討mTOR通路是否通過CD44分子促進軸突生長，進而提高神經(jīng)元的再生能力。 方法：體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，并用10μM全反式維甲酸(RTRA)誘導分化3d，用倒置顯微鏡觀察誘導組SH-SY5Y細胞形態(tài)變化情況，并設立對照組。利用RT-PCR及免疫組織化學染色技術檢測實驗誘導組與對照組SH-SY5Y細胞微管相關蛋白(Microtubule associated protein MAP2)表達及轉錄情況，進而驗證實驗組與對照組細胞分化程度的差異；隨后對分化成熟的細胞進行PTEN RNAi實驗，利用熒光顯微鏡對各實驗組細胞進行觀察，檢測實驗干擾組的熒光轉染效率；利用RT-PCR技術對干擾24h后各實驗組細胞PTEN的轉錄水平進行檢測；利用western blot技術對干擾36h后磷酸化核糖體(Ps6K)蛋白與雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表達水平進行檢測；利用RT-PCR技術檢測CD44轉錄水平，并與對照組進行比較，觀測CD44表達水平與軸突生長關系是否呈現(xiàn)正相關；將誘導后的細胞同時進行PTEN與CD44基因的共同干擾，并觀察兩種基因轉錄共同下調后，細胞軸突的長度變化情況。 結果： RT-PCR結果證實誘導3d的細胞與對照組相比較，MAP2的轉錄水平明顯上調。免疫組織化學方法證實，誘導3d的細胞與對照組相比較MAP2陽性細胞數(shù)明顯增加。隨后我們用RNAi技術對誘導分化的SH-SY5Y細胞進行PTEN基因干擾，24h后用RT-PCR技術檢測PTEN基因的轉錄水平，與對照組相比，其轉錄水平明顯下調。36h后我們再次檢測干擾后細胞的mTOR與Ps6K蛋白的表達水平，與陰性對照組和空白對照組相比，其蛋白表達水平明顯上調，差異顯著（p0.05）。干擾PTEN基因24h之后，發(fā)現(xiàn)實驗組CD44轉錄水平上調，與陰性對照組和單純誘導組相比差異顯著（p0.05）。隨后利用imageproplus6.0分別對各實驗組細胞進行軸突長度測量，并將各組數(shù)據(jù)分別進行統(tǒng)計學分析。結果表明，實驗干擾3d細胞的軸突長度明顯長于單純誘導組和陰性對照組細胞的軸突長度，差異顯著（P0.05），當PTEN RNAi與CD44RNAi共同干擾時，PTEN單純干擾組細胞軸突長度明顯長于共同干擾組和單純誘導組細胞的軸突長度，差異顯著（P0.05）。 結論：mTOR通路激活后通過CD44分子表達上調促進神經(jīng)細胞突起生長，從而促進神經(jīng)元的再生。
【關鍵詞】：mTOR通路 CD44 神經(jīng)再生 軸突生長 神經(jīng)損傷
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741
【目錄】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文縮略詞12-14
• 第一章 文獻綜述14-27
• 1.1 神經(jīng)軸突生長抑制因子及其受體復合物研究進展14-17
• 1.1.1 軸突生長抑制因子14-16
• 1.1.2 相關抑制因子受體復合物研究進展16-17
• 1.1.3 改善局部微環(huán)境的治療手段17
• 1.2 影響中樞神經(jīng)元內源性再生能力的因素17-27
• 1.2.1 生長調控機制與神經(jīng)再生18-19
• 1.2.2 mTOR 信號通路19-22
• 1.2.3 CD44 的研究進展22-27
• 第二章 材料與方法27-38
• 2.1 實驗試劑27-28
• 2.2 實驗儀器28-29
• 2.3 實驗細胞29
• 2.4 實驗試劑配制29-31
• 2.5 實驗方法31-38
• 2.5.1 神經(jīng)細胞模型的建立31-32
• 2.5.2 用 RT-PCR 技術及免疫組織化學方法檢測誘導細胞的分化程度32-34
• 2.5.3 通過 RNA 干擾技術使 PTEN 表達下調34-35
• 2.5.4 Western blot 檢測干擾 36h 后 mTOR，Ps6K 蛋白的表達水平35-36
• 2.5.5 RT-PCR 檢測 CD44 及 TUBB3 轉錄水平36
• 2.5.6 統(tǒng)計學處理與圖像的分析，軸突長度的測量36-38
• 第三章 實驗結果38-46
• 3.1 全反式維甲酸（RTRA）誘導 SY5Y 細胞分化38
• 3.2 誘導細胞分化程度的鑒定38-39
• 3.3 應用 RNAi 技術使 PTEN 表達下調并檢測其轉錄水平39-40
• 3.4 Western blot 技術檢測 PTEN 基因下調后，mTOR 蛋白，Ps6K 蛋白表達水平40-41
• 3.5 免疫組織化學方法檢測 Ps6K 蛋白表達水平41-42
• 3.6 PTEN 抑制后，mTOR 通路激活對 SY5Y 細胞突起長度的影響42-43
• 3.7 檢測各實驗組 CD44 轉錄水平43
• 3.8 檢測各實驗組 TUBB3 轉錄水平43-44
• 3.9 共同干擾實驗44-46
• 第四章 討論46-50
• 第五章 結論50-51
• 參考文獻51-57
• 作者簡介及在學期間所取得的科研成果57-58
• 致謝58

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 申崇標;陳力學;劉寶松;周冀英;曾照芳;邵陽;;下調PTEN基因對全腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元損傷的保護作用研究[J];解放軍醫(yī)學雜志;2010年07期

  本文關鍵詞：mTOR通路通過CD44促進神經(jīng)元再生的內在機制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：383013