本文關鍵詞：Foxo1-KLF2-S1P1及相關分子在重癥肌無力患者胸腺表達的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)是由乙酰膽堿受體抗體(Acetylcholine Receptor antibody,n ACh R-Ab)介導,細胞免疫依賴和補體參與的神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction,NMJ)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞障礙的一種自體免疫性疾病。文獻報道顯示重癥肌無力患者胸腺上皮細胞存在骨骼肌的共同抗原(n ACh R),該抗原能夠致敏T細胞繼而激活B細胞,產(chǎn)生抗n ACh R的抗體(Ach R-Ab)。約70%--80%的重癥肌無力病人胸腺異常(胸腺瘤、胸腺肥大及淋巴濾泡增生等),在胸腺中已檢出Ach R亞單位m RNA,重癥肌無力患者胸腺源性T細胞及B細胞對Ach R應答較外周血同類細胞強,且有顯著的T細胞功能異常。在切除胸腺后病情得到了改善,提示了胸腺在MG的發(fā)病中有著重要的作用。胸腺是T細胞分化發(fā)育成熟的場所,大量的體液免疫研究已經(jīng)表明了n ACh R作為重癥肌無力的靶分子所遭到的損害,是由n Ach R-Ab介導的:而n Ach R-Ab對n ACh R的免疫應答則是需要依賴T細胞的,T細胞在MG自身免疫中起到了關鍵性的作用,但T細胞在胸腺的分化過程還存在著許多問題有待研究。T細胞的發(fā)育是一個高度有序且多階段的過程,在不同的發(fā)育階段需要依賴于胸腺微環(huán)境所提供的各種不同的信號。對于成熟單陽性胸腺細胞如何遷出胸腺的這一問題,近年來有研究顯示,S1P1介導的信號在調(diào)節(jié)成熟單陽性胸腺細胞的輸出中有著重要的作用,提示S1P1在單陽性胸腺細胞表達是成熟T細胞從胸腺輸出進入外周的關鍵分子。這在S1P1基因缺陷小鼠胸腺細胞分化和遷出實驗中得到證實,但在人類胸腺細胞分化、遷出中的作用尚未得到證實,這為我們研究重癥肌無力的發(fā)病機制提供了一個切入點。本研究對比分析S1P1及其上游分子Foxo1、KLF2在重癥肌無力胸腺和正常對照胸腺表達的差異,探討Foxo1-KLF2-S1P1在重癥肌無力患者胸腺成熟T細胞輸出中的作用,分析其與疾病發(fā)生的關系。方法收集鄭州大學第二附屬醫(yī)院胸外科經(jīng)臨床確認手術切除的15例重癥肌無力患者胸腺(病理類型均為胸腺增生型),設定為MG組;15例非自身免疫先天性心臟病行開胸手術者胸腺,設定為正常對照組。1.Foxo1、KLF2、S1P1及CD62L、CCR7、CD69的m RNA的檢測:提取MG患者組及正常對照胸腺組織的總RNA,通過熒光定量RT-PCR檢測Foxo1、KLF2、S1P1及CD62L、CCR7、CD69的m RNA表達水平,采用2-△△Ct法在MG患者組和正常對照組之間進行相對定量;2.Foxo1、S1P1及CD62L、CCR7、CD69分子在胸腺細胞的表達:制作胸腺組織切片,通過免疫組織化學技術了解Foxo1、S1P1、CD62L、CD69、CCR7在胸腺組織的分布與表達;3.Foxo1及S1P1蛋白的定量分析:提取胸腺組織蛋白,通過Western blot定量檢測比較Foxo1和S1P1蛋白水平表達有無差異。4.血清中S1P水平的檢測:通過ELISA法檢測比較MG患者和正常對照組血清中S1P的水平。5.統(tǒng)計學分析:應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(SX±)表示,兩組均數(shù)的比較用t檢驗,當p0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.Foxo1、KLF2、S1P1及CD62L、CCR7、CD69 m RNA在胸腺的表達:實時定量RT-PCR結果顯示,與正常胸腺相比Foxo1及其下游分子KLF2、S1P1、CCR7、CD69在重癥肌無力患者胸腺中的表達顯著增高(p0.05),CD62L表達無差異。2.Foxo1、S1P1及CD62L、CCR7、CD69分子在胸腺細胞的表達:免疫組織化學結果表明,Foxo1、S1P1、CCR7在MG患者及對照組胸腺都有表達,主要分布在髓質(zhì)區(qū),MG患者胸腺組織髓質(zhì)區(qū)擴大,Foxo1、S1P1、CCR7陽性細胞數(shù)明顯多于正常對照組胸腺組織(p0.05)。3.Foxo1及S1P1蛋白定量分析:Western blot結果表明,Foxo1和S1P1蛋白在MG患者及對照組胸腺中都有表達;與正常對照相比,MG患者胸腺中Foxo1和S1P1蛋白表達水平明顯增高(p0.05)。4.血清S1P的含量:ELISA結果顯示,在MG患者和正常對照組的外周血中,S1P的濃度未見顯著差異(p0.05)。結論MG患者胸腺組織Foxo1及其下游分子KLF2、S1P1的表達顯著高于正常胸腺;MG患者Foxo1-KLF2-S1P1信號軸的高表達可能是MG患者胸腺細胞的異常輸出的原因。
【關鍵詞】：重癥肌無力 胸腺 T細胞 Foxo1 KLF2 S1P1
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R746.1
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 中英文縮略詞對照表13-14
• 1 前言14-16
• 2 材料和方法16-31
• 2.1 材料16-19
• 2.1.1 研究對象16
• 2.1.2 主要試劑16-17
• 2.1.3 主要實驗儀器17-19
• 2.2 實驗方法19-31
• 2.2.1 主要溶液的配置19-20
• 2.2.2 qRT-PCR檢測基因mRNA表達水平20-25
• 2.2.3 免疫組織化學檢測蛋白分布表達25-26
• 2.2.4 Western blot檢測蛋白表達26-29
• 2.2.5 ELISA檢測S1P在人外周血含量29-30
• 2.2.6 統(tǒng)計學分析30-31
• 3 結果31-38
• 3.1 MG患者與對照組胸腺組織中Foxo1、KLF2、S1P1、CD62L、 CCR7、CD69 的mRNA表達水平31-33
• 3.1.1 目的基因和內(nèi)參的標準曲線制定31-32
• 3.1.2 Foxo1、KLF2、S1P1、CD62L、CCR7、CD69 的擴增結果32-33
• 3.2 MG患者與對照組胸腺組織中Foxo1、S1P1、CCR7、CD69 和CD62L分子的分布與表達33-35
• 3.2.1 Foxo1，S1P1，CCR7 在MG患者和對照胸腺組織中的分布表達33-34
• 3.2.2 CD62L 在 MG 患者和對照胸腺組織中的分布表達34
• 3.2.3 CD69 在MG胸腺和正常胸腺組織的表達34-35
• 3.3 Western blot檢測MG患者與對照組胸腺組織中Foxo1 和S1P1蛋白表達水平35-36
• 3.4 ELISA測定MG患者與對照組血清中S1P濃度水平36-38
• 3.4.1 根據(jù)實驗測得的標準品數(shù)據(jù)繪制標準曲線36
• 3.4.2 兩組之間比較血清中S1P濃度水平36-38
• 4 討論38-41
• 4.1 Foxo1-KLF2-S1P1 在MG組和正常對照組中的表達39
• 4.2 轉(zhuǎn)錄因子Foxo1 下游分子在MG組和正常對照組中的表達39-40
• 4.3 MG組和正常對照組的外周血中S1P濃度水平40-41
• 5 小結41-42
• 參考文獻42-46
• 綜述 T細胞在胸腺的發(fā)育分化過程46-65
• 參考文獻58-65
• 個人簡歷65-66
• 致謝66

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  本文關鍵詞：Foxo1-KLF2-S1P1及相關分子在重癥肌無力患者胸腺表達的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：344612