本文關(guān)鍵詞：丁香酚經(jīng)嗅覺通路改善MCAO大鼠缺血神經(jīng)功能的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的:腦缺血疾病在臨床上主要治療手段是長期口服抗凝藥物或者擴(kuò)血管藥物。其損傷機(jī)制主要是氧化損傷、免疫炎癥介質(zhì)釋放、神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺失與釋放等。針對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用,在以往的研究中我們發(fā)現(xiàn)芳香小分子物質(zhì)可以通過嗅覺通路與相應(yīng)的神經(jīng)元受體結(jié)合,調(diào)節(jié)相應(yīng)的神經(jīng)元細(xì)胞。芳香物質(zhì)經(jīng)嗅覺通路的給藥方式對于腦缺血疾病可能是一種新的防治手段。人類嗅覺與腦功能之間聯(lián)系密切,嗅覺在一定程度上影響生命本能、學(xué)習(xí)記憶能力、情緒調(diào)節(jié)等。嗅覺還與人類的生命活動(dòng)和生活質(zhì)量密切相關(guān),嗅覺功能障礙一般會(huì)發(fā)生在一些重大疾病的初期。嗅覺對大腦皮質(zhì)、海馬、杏仁核、下丘腦、紋狀體、梨狀皮層、內(nèi)嗅皮質(zhì)等腦區(qū)神經(jīng)肽都有調(diào)節(jié)作用。那么嗅覺通路對腦缺疾病后損傷是否有影響呢?作為嗅覺吸嗅的給藥方式相對于口服和注射給藥方便安全,高特異性,高敏感度,芳香分子經(jīng)嗅覺通路給藥對于腦缺血疾病能否起到干預(yù)作用?其作用機(jī)制又是什么?本實(shí)驗(yàn)通過大鼠MCAO模型探討揮發(fā)性芳香物質(zhì)丁香酚,通過嗅覺通路給藥方式對于腦缺血后損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。第一部分MCAO大鼠的模型制備及神經(jīng)功能評分方法采用大腦中動(dòng)脈內(nèi)線栓阻斷法制造大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,缺血2h后再灌注24h,參照Longa評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分,將評分為1~3分的用做實(shí)驗(yàn)用鼠,隨機(jī)分組為丁香酚組和模型組,行假手術(shù)成功的大鼠歸類為假手術(shù)組。共分四組:丁香酚組、模型組、假手術(shù)組和正常組。結(jié)果神經(jīng)功能評分1~3分歸為模型組和丁香酚組,大鼠有明顯的轉(zhuǎn)圈、傾倒、前肢無法伸展的表現(xiàn)。假手術(shù)組和正常組神經(jīng)功能評分為0,無任何異常表現(xiàn)。第二部分丁香酚經(jīng)嗅覺通路干預(yù)MCAO大鼠及神經(jīng)行為學(xué)觀察方法丁香酚組給予吸嗅丁香酚3w后,其余組別不作處理正常飼養(yǎng),各組再次進(jìn)行神經(jīng)功能評分后取部分處死,腦切片行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色,計(jì)算腦梗死容積百分比;通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測大鼠腦缺血干預(yù)后的學(xué)習(xí)記憶能力和空間探索能力。結(jié)果神經(jīng)功能評分中丁香酚組與模型組比較,差異有顯著性意義(P0.01);大鼠腦缺血/再灌注后各組均出現(xiàn)白色缺血梗死灶,丁香酚組梗死灶面積/腦切片面積與模型組比較明顯降低,差異有顯著性意義(P0.05);水迷宮實(shí)驗(yàn)在定位航行實(shí)驗(yàn)中,正常組和假手術(shù)組逃避潛伏期折線波動(dòng)基本重合,丁香酚組的逃避潛伏期折線波動(dòng)居中,明顯短于模型組,差異有顯著性意義(P0.05);模型組的逃避潛伏期最長,明顯長于正常組和假手術(shù)組(P0.05);在空間探索實(shí)驗(yàn)中,正常組與假手術(shù)組無差異,模型組每分鐘穿越隱匿平臺(tái)位置的平均次數(shù)最少,與其余組比較都有顯著性差異(P0.05);丁香酚組的平均探索次數(shù)明顯多于模型組,兩者比較差異有顯著性意義(P0.05)。第三部分丁香酚干預(yù)后神經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及腦內(nèi)5-HT、BDNF的變化方法通過神經(jīng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)可以顯示丁香酚吸嗅能夠改善大鼠腦缺血后的認(rèn)知記憶能力。為探索丁香酚作用的機(jī)制,將干預(yù)后的各組大鼠處死取腦,腦切片行HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)。免疫組化方法測定腦區(qū)內(nèi)5-HT和BDNF表達(dá)的變化。對大鼠海馬CA3區(qū)進(jìn)行圖像分析,檢測5-HT和BDNF在海馬CA3區(qū)陽性反應(yīng)物平均光密度。結(jié)果HE染色顯示假手術(shù)組和正常組細(xì)胞數(shù)量多,排列整齊,形態(tài)呈圓形或橢圓形,結(jié)構(gòu)清晰;模型組細(xì)胞數(shù)量減少,形態(tài)小而不規(guī)則,結(jié)構(gòu)不清晰;丁香酚組較模型組細(xì)胞數(shù)量增加、結(jié)構(gòu)較清晰。免疫組化結(jié)果顯示5-HT和BDNF的免疫反應(yīng)物都為棕褐色,假手術(shù)組、正常組5-HT和BDNF的免疫反應(yīng)呈強(qiáng)陽性,丁香酚組5-HT和BDNF的免疫反應(yīng)中等,模型組5-HT和BDNF的免疫反應(yīng)較弱,且細(xì)胞數(shù)量較少,大鼠腦組織海馬CA3區(qū)免疫組化5-HT和BDNF蛋白表達(dá)量平均光密度經(jīng)組間比較,丁香酚組、正常組、假手術(shù)組與模型組比較5-HT平均光密度(P0.01),BDNF平均光密度(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第四部分通過反向虛擬篩選探討丁香酚可能的作用機(jī)制方法利用分子對接軟件Surflex,以丁香酚為活性小分子探針,與sc PDB數(shù)據(jù)庫中8077個(gè)蛋白晶體進(jìn)行虛擬對接,找出最有可能結(jié)合的蛋白質(zhì)受體,分析藥物的作用機(jī)理,為下一步實(shí)驗(yàn)提供理論指導(dǎo)。反向虛擬篩選的結(jié)果不但可將以往的研究進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié),還可以對丁香酚的潛在作用靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果經(jīng)Surflex_score打分排序,篩選出前20位的蛋白晶體作為丁香酚的藥用靶標(biāo)。主要有羧乙基精氨酸β-內(nèi)酰胺酶,凝血酶,次甲基四氫中膽色烷尿膽素原氫化酶,氧化還原酶結(jié)核水楊酸合成酶等。打分前20位的蛋白晶體見表4。β-內(nèi)酰胺酶和次甲基四氫中膽色烷尿膽素原氫化酶與丁香酚已知的抗炎抗氧化作用基本一致。凝血酶與丁香酚的結(jié)合模式見圖10D,因凝血酶具有抗凝,抑制血小板聚集的作用,對于腦缺血損傷可能是丁香酚潛在的作用機(jī)制。結(jié)論1.嗅覺通路與腦缺血疾病密切相關(guān)。2.丁香酚經(jīng)嗅覺通路吸嗅后可以改善MCAO模型大鼠的缺血后損傷,其機(jī)制可能與腦內(nèi)海馬區(qū)5-HT、BDNF的表達(dá)有關(guān)。3.通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行丁香酚靶標(biāo)的反向虛擬篩選,篩選出的一部分靶點(diǎn)和已知文獻(xiàn)報(bào)道的藥理作用基本一致,其中凝血酶蛋白質(zhì)靶點(diǎn)可能與丁香酚對于缺血疾病的干預(yù)治療作用有關(guān),可以設(shè)計(jì)下一步實(shí)驗(yàn),對丁香酚改善腦缺血疾病的作用機(jī)制做進(jìn)一步的探索。
【關(guān)鍵詞】：丁香酚 嗅覺通路 MCAO 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 5-HT 反向虛擬篩選
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R743
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-19
• 第一部分 MCAO大鼠的模型制備及神經(jīng)功能評分19-21
• 1. 材料與方法19-20
• 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-21
• 第二部分 丁香酚經(jīng)嗅覺通路干預(yù)MCAO大鼠及神經(jīng)行為學(xué)觀察21-27
• 1. 材料與方法21-23
• 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果23-27
• 第三部分 丁香酚干預(yù)后神經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及腦內(nèi)5-HT、BDNF的變化27-35
• 1. 材料與方法27-30
• 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-35
• 第四部分 通過反向虛擬篩選探討丁香酚可能的作用機(jī)制35-40
• 1. 實(shí)驗(yàn)方法35-36
• 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-40
• 討論40-47
• 結(jié)論47
• 創(chuàng)新點(diǎn)47-48
• 進(jìn)一步研究方向48-49
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 附錄55-56
• 致謝56-57
• 綜述57-65
• 參考文獻(xiàn)63-65

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