本文關鍵詞：基于MMP-2為靶點的腦膠質(zhì)瘤磁共振分子探針的構建及其生物學檢測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,具有惡性程度高、易復發(fā)、預后差等臨床特點。多年來,診斷檢查一直是膠質(zhì)瘤面臨的重要課題之一,準確及時的診斷對于后期控制病情、提高綜合治療效果有重要意義。研究表明,膠質(zhì)瘤高死亡率的一個重要原因就在于腫瘤細胞高度侵襲能力,這也是膠質(zhì)瘤的典型生物學特性[1]。其侵襲過程同其他顱外腫瘤一樣,經(jīng)歷了粘附、降解、移動三個步驟,即瘤細胞粘附到細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM),并分泌蛋白酶將局部基質(zhì)降解,然后伸出偽足向被降解的區(qū)域運動。基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)既是降解細胞外基質(zhì)(ECM)成分的重要酶類,在腫瘤的侵襲過程中起重要作用[2]。有研究指出膠質(zhì)瘤的級別即惡性程度與其中MMP-2表達強度有關,惡性程度越高,免疫組化結果顯示MMP-2陽性表達強度也隨之增高[3]。磁共振成像因其優(yōu)越的軟組織分辨率和對比度,一直是腦膠質(zhì)瘤診斷和治療首選的成像技術。而可作為磁共振成像對比劑的超小超順磁性氧化鐵顆粒(Utrasmall Superparamagnetic Iron Oxide,USPIO)具有較常規(guī)MRI造影劑更高的敏感性及飽和磁性,弛豫率是同樣條件下常規(guī)MRI造影劑的7-10倍[4],且直徑不到20nm,可以避免被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)(RES)吞噬。通過對其表面進行修飾,可用于帶有特定分子的細胞組織顯像[5],它能夠降低MRI T2的信號強度[6,7],且USPIO的毒副作用較低,在進入人體血漿鐵池后可被降解,繼而被細胞所代謝[8-11]。本實驗設計利用基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的多克隆抗體Ab-MMP-2與超小超順磁性氧化鐵顆粒(Utrasmall Superparamagnetic Iron Oxide,USPIO)偶聯(lián),形成一種具有特異性靶向功能的分子影像探針Ab-MMP-2-USPIO,并對該分子探針的免疫活性、細胞毒性以及與大鼠膠質(zhì)瘤細胞的特異性結合能力等進行體外檢測,探討其在腦膠質(zhì)瘤的磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)分子影像學診斷中應用的可行性及有效性,為腦膠質(zhì)瘤的診斷提供新的思路和方向。方法:第一部分:檢測三種細胞系中基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達情況分別采用免疫熒光法及蛋白質(zhì)印跡法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)在大鼠星形膠質(zhì)細胞系(RA)、大鼠膠質(zhì)瘤細胞系(C6)和人星形膠質(zhì)瘤細胞系(U87)中的表達情況;第二部分:利用碳二亞胺(EDC)法將基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的多克隆抗體Ab-MMP-2與超小超順磁性氧化鐵顆粒(USPIO)偶聯(lián),制備分子影像探針Ab-MMP-2-USPIO;第三部分:檢測合成后分子探針(Ab-MMP-2-USPIO)的生物活性及其與靶細胞的特異性結合能力;1采用Western blotting法檢測合成后的Ab-MMP-2-USPIO分子探針的免疫活性;2 MTT比色法檢測不同濃度(0、25、50、75、150、300、600ug/ml)的Ab-MMP-2-USPIO分子探針對于正常大鼠星形膠質(zhì)細胞(RA)的細胞毒性;3 Annexin V-FITC/PI流式細胞雙染法檢測濃度為75 ug/ml的Ab-MMP-2-USPIO分子探針對于正常大鼠星形膠質(zhì)細胞(RA)以及大鼠膠質(zhì)瘤細胞(C6)的致凋亡作用;4運用普魯士藍染色法檢測濃度為75 ug/ml的Ab-MMP-2-USPIO分子探針與大鼠膠質(zhì)瘤細胞(C6)中MMP-2蛋白的特異性結合能力。結果:1免疫熒光法結果顯示MMP-2蛋白在大鼠星形膠質(zhì)細胞(RA)內(nèi)沒有特異性熒光表達,但在大鼠膠質(zhì)瘤細胞(C6)和人星形膠質(zhì)瘤細胞(U87)的胞質(zhì)內(nèi)呈高表達狀態(tài);Western blotting結果可見大鼠膠質(zhì)瘤細胞(C6)和人星形膠質(zhì)瘤細胞(U87)組均出現(xiàn)條帶,證實了兩種細胞中MMP-2蛋白的表達,但正常大鼠星形膠質(zhì)細胞(RA)組未檢測出MMP-2蛋白表達。2在對合成的分子探針Ab-MMP-2-USPIO的檢測中:Western blotting結果顯示Ab-MMP-2-USPIO與MMP-2蛋白有著較高的結合度,與該抗原的多克隆抗體Ab-MMP-2相似;MTT比色法結果顯示Ab-MMP-2-USPIO的細胞毒性低,超過150ug/ml的劑量培養(yǎng)72h才出現(xiàn)明顯的細胞毒性,后續(xù)實驗中所采用的濃度(75ug/ml)對于正常大鼠星形膠質(zhì)細胞無明顯毒性,處于安全水平;Annexin V-FITC/PI流式細胞雙染法檢測結果顯示濃度為75ug/ml的Ab-MMP-2-USPIO與正常大鼠星形膠質(zhì)細胞(RA)以及大鼠膠質(zhì)瘤細胞(C6)共培養(yǎng)48h和72h均不會致明顯的細胞凋亡;普魯士藍染色的結果顯示,相對正常大鼠星形膠質(zhì)細胞(RA),大鼠膠質(zhì)瘤細胞(C6)細胞能夠大量攝取Ab-MMP-2-USPIO。結論:體外實驗的結果表明,MMP-2蛋白在正常大鼠星形膠質(zhì)細胞(RA)中不表達,在膠質(zhì)瘤細胞系C6和U87細胞中高表達,且人工合成的Ab-MMP-2-USPIO分子探針對細胞的毒性較小,致凋亡效果不明顯,同時與大鼠膠質(zhì)瘤細胞(C6)有著較高的特異性結合能力。為進一步的體內(nèi)實驗奠定了基礎,有望成為提高腦膠質(zhì)瘤MRI診斷準確性的新型靶向納米核磁共振造影劑。
【關鍵詞】：膠質(zhì)瘤 磁共振成像 超小超順磁性氧化鐵顆粒 基質(zhì)金屬蛋白酶-2 分子探針 細胞毒性
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.4
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-25
• 結果25-27
• 附圖27-31
• 討論31-33
• 結論33
• 參考文獻33-38
• 綜述 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子影像學研究進展38-51
• 參考文獻46-51
• 致謝51-52
• 個人簡歷52

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 趙紅宇;基質(zhì)金屬蛋白酶-2和-9對惡性膠質(zhì)瘤干細胞侵襲作用的影響[D];中國醫(yī)科大學;2009年

  本文關鍵詞：基于MMP-2為靶點的腦膠質(zhì)瘤磁共振分子探針的構建及其生物學檢測，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：338389