發(fā)布時(shí)間：2017-05-01 02:08

  本文關(guān)鍵詞：DRP1-Ser637去磷酸化促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞線粒體自噬在咖啡因抗帕金森病中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：線粒體是細(xì)胞合成能量的主要場(chǎng)所,線粒體維持正常的形態(tài)與功能是保證細(xì)胞進(jìn)行其他生理活動(dòng)的重要基礎(chǔ)。其中,DRP1是控制線粒體斷裂的關(guān)鍵蛋白,在維持線粒體動(dòng)態(tài)平衡中起著關(guān)鍵作用。帕金森氏癥(Parkinson’s disease,PD)是常見的神經(jīng)退行性疾病之一,大量研究表明線粒體損傷與PD的發(fā)病密切相關(guān)。自噬是細(xì)胞 自我消化‖的一個(gè)重要途徑,也是清除受損傷線粒體的有效途徑。自噬過程能夠順利進(jìn)行是清除損傷線粒體的重要保障。在神經(jīng)細(xì)胞上,利用魚藤酮(Rotenone)建立PD體外細(xì)胞模型是研究PD的常用細(xì)胞模型之一。Rotenone引發(fā)PD的機(jī)制與線粒體動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞,蛋白質(zhì)質(zhì)量控制途徑缺陷以及自噬-溶酶體通路被抑制有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)高濃度和低濃度的Rotenone在PD細(xì)胞模型中能產(chǎn)生不同的自噬結(jié)果。但是關(guān)于Rotenone濃度的改變與自噬發(fā)生的分子機(jī)制之間的關(guān)系目前并不清楚。據(jù)此,本研究將從線粒體動(dòng)力學(xué)的角度,尤其是Rotenone對(duì)DRP1磷酸化/去磷酸化過程的影響,進(jìn)一步解釋Rotenone與自噬之間的關(guān)系。咖啡因(caffeine)作為具有保護(hù)神經(jīng)元作用的常見的嘌呤類生物堿,流行病學(xué)調(diào)查及生物學(xué)研究已經(jīng)證明攝入一定量Caffeine能夠降低患有PD的風(fēng)險(xiǎn),但是關(guān)于Caffeine降低患PD風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制尚未完全闡明。因此我們對(duì)Caffeine是否也能通過影響線粒體動(dòng)力學(xué)來提高細(xì)胞自噬水平,從而起到緩解PD的效果進(jìn)行了考察。首先,本實(shí)驗(yàn)采用Rotenone建立PD細(xì)胞模型,對(duì)Caffeine是否也能通過增加DRP1 Serine 637位點(diǎn)去磷酸化誘導(dǎo)線粒體自噬清除受損傷的線粒體這一機(jī)制來緩解PD進(jìn)行考察。通過MTT法我們選擇了10μM Rotenone作用24 h來建立PD細(xì)胞模型。本研究前期通過Western blot方法考察不同濃度Rotenone對(duì)細(xì)胞自噬水平的影響進(jìn)行考察,同時(shí)檢測(cè)加入自噬抑制劑3-MA和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(Rapamycin)后細(xì)胞的自噬水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3μM Rotenone作用24 h能夠顯著增加SH-SY5Y細(xì)胞的自噬水平。除此之外,3μM Rotenone還能夠減少Ser637p-DRP1蛋白表達(dá),即3μM Rotenone能夠增加Ser637p-DRP1蛋白去磷酸化過程。另外研究表明,Ser637p-DRP1蛋白去磷酸化能夠?qū)е戮�粒體斷裂水平的增加。隨后我們通過激光共聚焦技術(shù)拍攝到3μM Rotenone增加的自噬小體和線粒體有良好的共定位。透射電子顯微鏡的結(jié)果中也能觀察到自噬雙層膜包裹的線粒體出現(xiàn),進(jìn)一步證明有線粒體自噬的發(fā)生。隨后通過加入DRP1特異性抑制劑Mdivi-1和FK506,對(duì)3μM Rotenone增加的自噬與Ser637p-DRP1蛋白去磷酸化以及線粒體自噬三者之間的聯(lián)系進(jìn)行考察。Western blot、激光共聚焦以及透射電子顯微鏡的共同結(jié)果顯示,給予DRP1特異性抑制劑能夠有效抑制DRP1的Serine 637位點(diǎn)去磷酸化,同時(shí)降低SH-SY5Y細(xì)胞的線粒體自噬水平,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3μM Rotenone可能通過促進(jìn)Ser637p-DRP1蛋白去磷酸化增加線粒體自噬水平。Ser637p-DRP1蛋白去磷酸化可能是3μM Rotenone增加線粒體自噬水平的分子機(jī)制。其次,我們對(duì)Caffeine是否也能通過以上機(jī)制緩解PD進(jìn)行考察。本研究在10μM Rotenone作用24 h建立的PD細(xì)胞模型上篩選了Caffeine的保護(hù)濃度和時(shí)間為10μM 24 h。并通過Western blot對(duì)PD的指標(biāo)酪氨酸羥化酶(TH)和α-突觸核蛋白(α-syn)的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示10μM Rotenone能夠降低TH的表達(dá),增加α-syn的表達(dá),給予Caffeine預(yù)保護(hù)后能夠顯著逆轉(zhuǎn)Rotenone對(duì)TH和α-syn的影響。隨后的檢測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)Caffeine能夠?qū)?xì)胞的自噬水平和Ser637p-DRP1蛋白的去磷酸化水平產(chǎn)生與3μM Rotenone相似的結(jié)果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的猜測(cè),在加入Caffeine的基礎(chǔ)上給予自噬抑制劑3-MA和DRP1特異性抑制劑FK506再次對(duì)線粒體自噬情況進(jìn)行考察。Western blot及激光共聚焦的結(jié)果均顯示,抑制Ser637p-DRP1去磷酸化的同時(shí),Caffeine促進(jìn)自噬水平的作用也被抑制,表明Caffeine的保護(hù)作用很有可能是通過增加Ser637p-DRP1去磷酸化誘導(dǎo)線粒體自噬實(shí)現(xiàn)的。最后,本實(shí)驗(yàn)以成年雄性Wistar大鼠為研究對(duì)象,應(yīng)用動(dòng)物行為學(xué)和高效液相色譜-電化學(xué)法考察Caffeine預(yù)處理對(duì)Rotenone誘發(fā)的PD大鼠是否具有保護(hù)作用。通過觀察和記錄大鼠發(fā)病率和自發(fā)活動(dòng)行為的改變?cè)u(píng)價(jià)Caffeine的改善作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Rotenone組大鼠均出現(xiàn)不同程度的行為缺陷,且發(fā)病率(100%)明顯高于Caffeine組;而Caffeine預(yù)保護(hù)組的大鼠的發(fā)病率及自發(fā)活動(dòng)均得到一定程度改善。高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,與Rotenone組比較,Caffeine能夠顯著提高大鼠紋狀體內(nèi)多巴胺的含量。綜上所述,Caffeine能夠在SH-SY5Y細(xì)胞模型和動(dòng)物模型上緩解Rotenone誘導(dǎo)的PD,且Caffeine緩解PD的分子機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)Ser637p-DRP1蛋白的去磷酸化,提高細(xì)胞線粒體自噬水平實(shí)現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：帕金森 自噬 Caffeine DRP1 Ser637p-DRP1 神經(jīng)保護(hù)作用
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R742.5
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-9
• 英文縮略詞表9-14
• 1 前言14-31
• 1.1 帕金森氏病研究進(jìn)展14-23
• 1.1.1 遺傳因素14-20
• 1.1.2 環(huán)境因素20-22
• 1.1.3 Rotenone誘導(dǎo)的PD模型22-23
• 1.2 自噬與PD23-25
• 1.3 線粒體動(dòng)力學(xué)25-28
• 1.3.1 線粒體斷裂和融合的分子機(jī)制25-26
• 1.3.2 線粒體斷裂與融合的調(diào)控26-27
• 1.3.3 DRP1 與PD27-28
• 1.4 Caffeine28-29
• 1.4.1 Caffeine與PD28-29
• 1.4.2 Caffeine與自噬29
• 1.5 立題依據(jù)29-31
• 2 Caffeine對(duì)Rotenone致SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其對(duì)Ser637p-DRP1 去磷酸化的影響31-55
• 2.1 材料與方法32-39
• 2.1.1 主要試劑32-33
• 2.1.2 主要設(shè)備33
• 2.1.3 細(xì)胞33-34
• 2.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)34
• 2.1.5 試劑的配制34-36
• 2.1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑配制34-35
• 2.1.5.2 Western blot試驗(yàn)相關(guān)試劑的配制35-36
• 2.1.6 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率36
• 2.1.7 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)36-38
• 2.1.8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染38
• 2.1.9 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體自噬38-39
• 2.1.10 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的線粒體自噬結(jié)構(gòu)39
• 2.1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析39
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-52
• 2.2.1 Rotenone能夠造成SH-SY5Y細(xì)胞損傷39-40
• 2.2.2 Caffeine能夠緩解Rotenone造成PD40-41
• 2.2.3 3μM Rotenone引起Ser637p-DRP1 去磷酸化及細(xì)胞自噬水平的增加41-43
• 2.2.4 Rotenone增加自噬水平與自噬抑制劑、自噬促進(jìn)劑比較43-44
• 2.2.5 3μM Rotenone增加了線粒體自噬水平44-46
• 2.2.6 DRP1 不同抑制劑對(duì)Rotenone誘導(dǎo)的自噬水平的影響46-47
• 2.2.7 DRP1 不同抑制劑對(duì)Rotenone誘導(dǎo)的線粒體自噬水平的影響47-49
• 2.2.8 透射電子顯微鏡觀察線粒體自噬的情況49
• 2.2.9 Caffeine對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞自噬水平和DRP1 磷酸化蛋白表達(dá)的影響49-50
• 2.2.10 Caffeine對(duì)PD的緩解作用可能與Ser637p-DRP1 去磷酸化引起的細(xì)胞自噬水平增加有關(guān)50-51
• 2.2.11 Caffeine誘導(dǎo)線粒體自噬緩解PD51-52
• 2.3 小結(jié)與討論52-55
• 3 Caffeine對(duì)Rotenone誘發(fā)大鼠PD模型的神經(jīng)保護(hù)作用55-62
• 3.1 材料與方法55-57
• 3.1.1 主要試劑55
• 3.1.2 主要設(shè)備55-56
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物56
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥56
• 3.1.5 行為學(xué)檢測(cè)方法56
• 3.1.6 高效液相色譜法檢測(cè)小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺含量56-57
• 3.1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析57
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-60
• 3.2.1 Caffeine能夠緩解Rotenone對(duì)大鼠的毒性作用57-58
• 3.2.2 Caffeine改善Rotenone誘發(fā)的PD模型大鼠自發(fā)活動(dòng)減少58-59
• 3.2.3 Caffeine改善Rotenone誘發(fā)的PD模型小鼠紋狀體多巴胺含量減少59-60
• 3.3 小結(jié)與討論60-62
• 4 結(jié)論和展望62-64
• 4.1 結(jié)論62-63
• 4.2 創(chuàng)新和突破63
• 4.3 展望63-64
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 致謝71-73
• 在校期間發(fā)表論文73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 祁婷婷;林霖;劉蕓;姜勇;;DJ-1與帕金森病[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2011年04期

2 ;Parallel relationship between microglial activation and substantia nigra damage in a rotenone-induced Parkinson's disease rat model[J];Neural Regeneration Research;2010年04期

3 ;Mutant alpha-synuclein and autophagy in PC12 cells[J];Neural Regeneration Research;2011年02期

4 周海燕,陳生弟;Parkin,Parkin底物和帕金森病[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2005年10期

  本文關(guān)鍵詞：DRP1-Ser637去磷酸化促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞線粒體自噬在咖啡因抗帕金森病中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：338011