本文關(guān)鍵詞：雌激素核受體在小鼠腰段脊髓表達特征，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是成年發(fā)病的以大腦運動皮層、腦干和脊髓中運動神經(jīng)元受累為特征的神經(jīng)變性疾病。流行病學(xué)顯示,絕經(jīng)期前男性發(fā)病率明顯高于女性,約為3-4:1,絕經(jīng)后這種差異減小,男女發(fā)病率約為1:1。研究發(fā)現(xiàn),雄性SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病時間早于雌性小鼠,卵巢摘除使小鼠壽命縮短,摘除卵巢后給予雌二醇明顯延緩疾病進展。流行病學(xué)研究及實驗研究均提示雌激素對ALS的發(fā)病及進展可能有保護作用。雌激素(Estrogen,E)是一種甾體類固醇性激素。除參與生育、性活動外,近年來發(fā)現(xiàn)雌二醇與其受體(estrogen receptor,ER)包括核受體ERα及β及膜受體GPR30結(jié)合后,調(diào)控基因表達、激活A(yù)PMK、Akt通路,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用,從而發(fā)揮的神經(jīng)保護作用。以往的研究多集中于AD、PD及卒中等發(fā)病過程中雌激素的腦保護機制研究,而對脊髓疾病的保護機制則集中于急性脊髓損傷、多發(fā)性硬化及體外的單細胞保護的研究,對肌萎縮側(cè)索硬化的神經(jīng)保護機制未見報道。如上所述,雌激素的生物功能主要由與受體結(jié)合后完成,以往研究發(fā)現(xiàn)ERα及ERβ在脊髓主要在后角I-III層表達,參與痛覺調(diào)節(jié),而在脊髓前角的分布未見系統(tǒng)的描述,為了研究雌激素的保護機制需要全面了解其受體的表達特征�；诖�,本實驗應(yīng)用免疫組化及激光共聚焦的方法觀察,雌激素核受體在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠腰段脊髓表達特征,為進一步研究雌激素在ALS發(fā)病過程中的神經(jīng)保護作用提供理論依據(jù)及可能的靶點。本研究分為兩部分,內(nèi)容如下:第一部分ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角的表達特征目的:觀察ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角運動神經(jīng)元的表達。方法:1實驗動物成年雄性CD1小鼠2免疫組化10%水合氯醛將成年雄性小鼠麻醉后,心臟灌注4%多聚甲醛固定20min,取小鼠脊髓腰段以4%多聚甲醛固定48h,振動切片25μm厚,免疫組織化學(xué)法觀察ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角運動神經(jīng)元的表達特征。3免疫熒光染色將固定好的腰段脊髓震蕩切片成25μm厚,應(yīng)用免疫熒光染色的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角運動神經(jīng)元的細胞定位。結(jié)果:在成年雄性小鼠腰段脊髓,ERα在前角中有表達,表達部位主要位于運動神經(jīng)元,且胞核高表達,胞漿中量表達。免疫熒光染色證實是α-運動神經(jīng)元。結(jié)論:ERα在成年雄性小鼠脊髓前角運動神經(jīng)元的胞核高表達,在胞漿中量表達。第二部分ERβ在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠腰段脊髓表達特征目的:觀察不同病變時期SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠ERβ的表達特征。方法:1模型建立及分組飼養(yǎng)繁殖家族性肌萎縮側(cè)索硬化動物模型SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠,分為癥狀前期(相當(dāng)于60天)、癥狀期(相當(dāng)于90天)及終末期(相當(dāng)于120天)3組,同窩別未轉(zhuǎn)基因的為對照組,每組各3只小鼠。2取材實驗動物經(jīng)10%水合氯醛腹腔內(nèi)麻醉后,4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定20min,留取小鼠脊髓腰膨大,在4%多聚甲醛固定48h。3免疫組化染色固定后的組織塊震蕩切片25μm厚,應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法進行染色,觀察ERβ在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠及對照組小鼠各時期腰段脊髓前角的表達特征。計數(shù)雙側(cè)脊髓前角ERβ免疫陽性α運動神經(jīng)元的數(shù)量。4免疫熒光染色4%多聚甲醛固定的組織塊震蕩切片25μm厚,應(yīng)用免疫熒光染色法進行染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰段脊髓ERβ的細胞定位。5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。采用均數(shù)±標準差表示腰段脊髓切片兩側(cè)脊髓前角α運動神經(jīng)元計數(shù)之和,三組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析,兩組數(shù)據(jù)的比較采用兩個獨立樣本比較的t檢驗,以P=0.05為顯著性檢驗標準。結(jié)果:1 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定子代鼠基因組DNA經(jīng)PCR擴增后、在GBOX-HR全自動凝膠成像系統(tǒng)下其瓊脂糖凝膠電泳,m SOD1的PCR產(chǎn)物為236bp,若200-300bp之間的有條帶,則該小鼠為SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠,若無此條帶,則為非SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠,即陰性小鼠。2 ERβ免疫組化2.1 ERβ在對照組小鼠脊髓灰、白質(zhì)均有表達,主要表達于細胞核;灰質(zhì)表達較白質(zhì)更明顯;脊髓后角I-III層高表達,脊髓前角廣泛表達,但表達密度較低。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠癥狀前期腰段脊髓ERβ的表達方式及強度與對照組無明顯區(qū)別。2.2隨著病情進展,SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠脊髓前角ERβ免疫陽性α運動神經(jīng)元數(shù)目逐漸減少,在癥狀前期、發(fā)病早期、終末期分別為24.30±1.25、14.40±1.50、3.1.±2.28,且各病變時期間均有顯著性差異(P0.05);而對照組分別為23.40±3.17、24.00±1.70、22.20±1.32,各時期間無顯著性差異(P0.05)。發(fā)病早期、終末期SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠組與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3免疫熒光染色ERβ在小鼠脊髓前角α運動神經(jīng)元及星型膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞的胞核均有表達,脊髓前角α運動神經(jīng)元胞漿少量表達。隨病程的進展,SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠脊髓前角ERβ免疫陽性的運動神經(jīng)元數(shù)目逐漸減少,反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞的胞核也有ERβ表達。結(jié)論:1 ERβ在小鼠脊髓前角α運動神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞均有表達,主要為核表達,在運動神經(jīng)元胞漿有少量表達。2 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠隨著病程進展,脊髓前角ERβ免疫陽性α運動神經(jīng)元數(shù)目逐漸減少,反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞也有ERβ的表達。
【關(guān)鍵詞】：肌萎縮側(cè)索硬化 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠 雌激素 脊髓前角 雌激核素受體 免疫組化 激光共聚焦
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R744.8
【目錄】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 英文縮寫13-14
• 引言14-15
• 第一部分 ERα在成年雄性小鼠腰段脊髓前角的表達特征15-28
• 前言15
• 材料與方法15-19
• 1 材料15-16
• 2 試驗方法16-19
• 結(jié)果19-20
• 附圖20-21
• 討論21-22
• 小結(jié)22
• 參考文獻22-28
• 第二部分 ERβ在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠腰段脊髓表達特征28-47
• 前言28
• 材料與方法28-33
• 1 材料28-31
• 2 動物31
• 3 試驗方法31-33
• 結(jié)果33-34
• 1 SOD1G93A 轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定33
• 2 ERβ免疫組化33
• 3 免疫熒光染色33-34
• 附圖34-39
• 附表39-40
• 討論40-42
• 小結(jié)42
• 參考文獻42-47
• 結(jié)論47-48
• 綜述 雌激素的神經(jīng)保護作用研究48-65
• 參考文獻53-65
• 致謝65-66
• 個人簡歷66

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本文編號：319324