研究背景和目的Sirtuin（Sirt1-7）是系統(tǒng)發(fā)育中高度保守的煙酰胺腺嘌呤核苷酸（NAD+）依賴性蛋白脫乙酰化酶家族。其中Sirt3主要存在于線粒體中,具有應(yīng)激反應(yīng)性脫乙酰酶活性,在多種病理?xiàng)l件下起到了減輕細(xì)胞損傷的作用。在熱量限制和應(yīng)激等狀態(tài)下,Sirt3可以調(diào)節(jié)線粒體功能,影響線粒體代謝,其中包括調(diào)控三磷酸腺苷（ATP）和活性氧（ROS）的產(chǎn)生。然而,Sirt3在氧化應(yīng)激性神經(jīng)元損傷中的作用并未完全明確。Sirt1是這個(gè)家族中另一個(gè)特征明顯的成員。已有研究證實(shí)Sirt1在抵抗細(xì)胞應(yīng)激性反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。然而,Sirt1和Sirt3之間的相互作用仍有待進(jìn)一步研究。自噬是細(xì)胞精確調(diào)控的自我消化過程,在饑餓、分化及細(xì)胞正常生長時(shí)通過溶酶體系統(tǒng)吞噬胞質(zhì)內(nèi)大分子及細(xì)胞器,以維持細(xì)胞的生存、分化、生長以及穩(wěn)定。細(xì)胞通過自噬機(jī)制選擇性地清除受損傷或不需要的線粒體的過程被稱為線粒體自噬。線粒體自噬可以作為一種防御機(jī)制清除損傷的線粒體和過量產(chǎn)生的ROS,確保細(xì)胞內(nèi)線粒體功能穩(wěn)定,促進(jìn)應(yīng)激環(huán)境中細(xì)胞的存活;反之,如果線粒體自噬的防御功能得不到充分發(fā)揮,過量產(chǎn)生的ROS將誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡等途徑... 

【文章來源】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)陜西省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：126 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
縮略語表
中文摘要
Abstract
前言
文獻(xiàn)回顧
    第一部分 Sirt3與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病
        1. Sirtuin概述
        2. Sirt3的分子生物學(xué)功能
            2.1 Sirt3的表達(dá)與調(diào)控
            2.2 Sirt3在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活與死亡中的作用
            2.3 Sirt3與衰老
            2.4 Sirt3與能量平衡
            2.5 Sirt3與氧化應(yīng)激
        3. Sirt3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用
            3.1 Sirt3與阿爾茨海默氏�。ˋlzheimer's disease,AD）
            3.2 Sirt3與亨廷頓舞蹈病（Huntington's disease,HD）
            3.3 Sirt3與肌萎縮性側(cè)索硬化癥（Amyotrophic lateral sclerosis ALS）
            3.4 Sirt3與年齡相關(guān)性聽力損失（Age-related hearing loss,AHL）
    第二部分 自噬在氧化應(yīng)激性損傷中的作用
        1. 自噬概述
        2. 自噬與氧化應(yīng)激
        3. 氧化應(yīng)激與DNA損傷
        4. DNA損傷與自噬
第一部分 Sirt3對過氧化氫引起的氧化應(yīng)激性損傷的作用
    引言
    1 材料
        1.1 細(xì)胞株
        1.2 小干擾RNA （Small interfering RNA;siRNA）的構(gòu)建
        1.3 慢病毒的構(gòu)建
        1.4 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.5 主要儀器
    2 方法
        2.1 體外細(xì)胞培養(yǎng)
2O₂細(xì)胞損傷模型的建立">        2.2 H₂O₂細(xì)胞損傷模型的建立
        2.3 細(xì)胞活性檢測
        2.4 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）釋放檢測
        2.5 siRNA轉(zhuǎn)染
        2.6 慢病毒轉(zhuǎn)染
+/NADH比值檢測">        2.7 NAD⁺/NADH比值檢測
        2.8 活性氧（ROS）生成檢測
        2.9 脂質(zhì)過氧化物檢測
        2.10 抗氧化酶活性檢測
        2.11 細(xì)胞線粒體的提取
        2.12 線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性檢測
        2.13 三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate,ATP）合成檢測
        2.14 線粒體腫脹檢測
        2.15 線粒體鈣緩沖容積檢測
        2.16 流式細(xì)胞分選
        2.17 細(xì)胞色素c（cytochrome c）釋放檢測
        2.18 半胱天冬酶-3（Caspase-3）活性檢測
        2.19 免疫印跡（Western Blot,WB）實(shí)驗(yàn)
        2.20 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3 結(jié)果
2O₂損傷的HT22模型中Sirt3的表達(dá)變化">        3.1 在H₂O₂損傷的HT22模型中Sirt3的表達(dá)變化
2O₂導(dǎo)致的Sirt3表達(dá)增高可以促進(jìn)HT22細(xì)胞的存活">        3.2 H₂O₂導(dǎo)致的Sirt3表達(dá)增高可以促進(jìn)HT22細(xì)胞的存活
        3.3 過表達(dá)Sirt3后可減輕ROS的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)
        3.4 Sirt3過表達(dá)可以保護(hù)線粒體呼吸鏈功能,增加ATP產(chǎn)生
2O₂導(dǎo)致的線粒體功能障礙">        3.5 過表達(dá)Sirt3可減輕H₂O₂導(dǎo)致的線粒體功能障礙
        3.6 過表達(dá)Sirt3可抑制線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
    4 討論
第二部分 Sirt3調(diào)節(jié)線粒體功能在氧化應(yīng)激性神經(jīng)元損傷中的作用
    引言
    1 材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 siRNA的構(gòu)建（與第一部分材料相同）
        1.3 慢病毒的構(gòu)建（與第一部分材料相同）
        1.4 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.5 主要儀器
        1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作器材
    2 方法
        2.1 小鼠原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)
2O₂神經(jīng)元損傷模型的建立（與第一部分方法相同）">        2.2 H₂O₂神經(jīng)元損傷模型的建立（與第一部分方法相同）
        2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)（Immunocytochemistry, ICC）
        2.4 siRNA轉(zhuǎn)染（與第一部分方法相同）
        2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染（與第一部分方法相同）
        2.6 神經(jīng)元活性檢測（與第一部分方法相同）
        2.7 LDH釋放檢測（與第一部分方法相同）
        2.8 細(xì)胞色素c釋放檢測（與第一部分方法相同）
        2.9 ROS生成檢測（與第一部分方法相同）
        2.10 caspase-3活性檢測（與第一部分方法相同）
        2.11 抗氧化物酶活性檢測（與第一部分方法相同）
        2.12 鈣離子呈像
        2.13 線粒體DNA含量檢測
        2.14 ATP合成檢測（與第一部分方法相同）
        2.15 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR （RT-qPCR）
        2.16 WB實(shí)驗(yàn)（與第一部分方法相同）
        2.17 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（與第一部分方法相同）
    3 結(jié)果
2O₂造成的原代皮層神經(jīng)元損傷模型中的表達(dá)變化">        3.1 Sirt3在H₂O₂造成的原代皮層神經(jīng)元損傷模型中的表達(dá)變化
2O₂造成的Sirt3表達(dá)增高可促進(jìn)損傷后神經(jīng)元的存活">        3.2 H₂O₂造成的Sirt3表達(dá)增高可促進(jìn)損傷后神經(jīng)元的存活
2O₂導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷">        3.3 Sirt3過表達(dá)可減輕H₂O₂導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷
2O₂造成的氧化應(yīng)激性損傷">        3.4 Sirt3過表達(dá)可以抑制H₂O₂造成的氧化應(yīng)激性損傷
2O₂造成的線粒體內(nèi)鈣紊亂">        3.5 Sirt3過表達(dá)可以減輕H₂O₂造成的線粒體內(nèi)鈣紊亂
2O₂損傷后促進(jìn)線粒體的生物合成">        3.6 Sirt3過表達(dá)可在H₂O₂損傷后促進(jìn)線粒體的生物合成
    4 討論
第三部分 Sirt3調(diào)控神經(jīng)元自噬在氧化應(yīng)激性神經(jīng)元損傷中的作用
    引言
    1 材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（與第二部分材料相同）
        1.2 慢病毒的構(gòu)建（與第二部分材料相同）
        1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.4 主要儀器
        1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作器材（與第二部分材料相同）
    2 方法
        2.1 小鼠原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)（與第二部分方法相同）
        2.2 神經(jīng)元氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation,OGD）模型的建立
        2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染（與第一部分方法相同）
        2.4 細(xì)胞活性檢測（與第一部分方法相同）
        2.5 TUNEL染色
        2.6 Caspase-3活性檢測（與第一部分方法相同）
        2.7 透射電子顯微鏡檢測
2O₂檢測">        2.8 ROS-GLO法H₂O₂檢測
2O₂含量">        2.9 通過氨基三唑介導(dǎo)過氧化氫酶滅活測定細(xì)胞內(nèi)H₂O₂含量
        2.10 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）檢測
        2.11 ATP合成檢測（與第一部分方法相同）
        2.12 免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry,ICC） （與第二部分方法相同）
        2.13 WB實(shí)驗(yàn)（與第一部分方法相同）
        2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（與第一部分方法相同）
    3 結(jié)果
        3.1 Sirt3對皮質(zhì)神經(jīng)元缺血有保護(hù)作用
        3.2 Sirt3對線粒體功能及細(xì)胞生物學(xué)功能有保護(hù)作用
        3.3 Sirt3參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元缺血性損傷后的神經(jīng)元自噬
        3.4 神經(jīng)元自噬與Sirt3的神經(jīng)保護(hù)作用密切相關(guān)
        3.5 Sirt3通過AMPK-mTOR途徑發(fā)揮其保護(hù)作用
    4 討論
第四部分 Sirt1-Sirt3軸通過影響血腦屏障通透性在氧化應(yīng)激性神經(jīng)損傷中的作用
    引言
    1 材料
        1.1 細(xì)胞系
        1.2 siRNA的構(gòu)建
        1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        1.4 主要儀器
    2 方法
        2.1 體外血腦屏障（blood-brain barrier, BBB）模型的構(gòu)建
        2.2 OGD氧化應(yīng)激性損傷模型的建立（與第三部分方法相同）
        2.3 siRNA轉(zhuǎn)染（與第一部分方法相同）
        2.4 血腦屏障通透性檢測
        2.5 流式細(xì)胞分選（與第一部分方法相同）
        2.6 線粒體分離和提�。ㄅc第一部分方法相同）
        2.7 線粒體中ROS含量的檢測
        2.8 WB實(shí)驗(yàn)（與第一部分方法相同）
        2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（與第一部分方法相同）
    3 結(jié)果
        3.1 Sirt1與Sirt3對氧化應(yīng)激性損傷后BBB通透性具有相反的作用
        3.2 在OGD損傷模型中,Sirt1通過AMPK-PGC1信號途徑調(diào)控Sirt3的表達(dá)
        3.3 Sirt1-Sirt3軸可影響OGD介導(dǎo)的BBB通透性增高
        3.4 在BBB模型中,Sirt1-Sirt3軸可調(diào)控OGD介導(dǎo)的細(xì)胞損傷
        3.5 線粒體ROS產(chǎn)生參與了Sirt1-Sirt3軸對OGD介導(dǎo)的BBB通透性及細(xì)胞損傷的調(diào)控
    4 討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡歷和研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]SIRT1 suppresses PMA and ionomycin-induced ICAM-1 expression in endothelial cells[J]. JIA YuYan,GAO Peng,CHEN HouZao,WAN YanZhen,ZHANG Ran,ZHANG ZhuQin,YANG RuiFeng,WANG Xu,XU Jing,LIU DePei.  Science China（Life Sciences）. 2013(01)



本文編號：3100282