背景與目的1型1磷酸鞘氨醇受體（Sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1P1）是G蛋白偶聯(lián)受體超家族表達(dá)最多和最廣泛的受體之一,在成人體內(nèi)高表達(dá)于免疫器官、肺和腦等組織,在腎臟中表達(dá)較低。利用抗S1P1抗體對小鼠胸腺進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色顯示,S1P1主要在胸腺髓質(zhì)區(qū)的胸腺細(xì)胞表面表達(dá)。胸腺髓質(zhì)區(qū)分布的細(xì)胞主要是單陽性胸腺細(xì)胞,Michael A等認(rèn)為單陽性T細(xì)胞從胸腺遷出是由其高表達(dá)的S1P1與S1P特異性識別結(jié)合介導(dǎo)的。S1P1的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白O1（Forkhead Box transcription O1,FoxO1）的調(diào)控。在哺乳類動物中,FoxO1高表達(dá)于成熟的T、B淋巴細(xì)胞,并且可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化及功能。FoxO1在胸腺細(xì)胞發(fā)育為單陽性細(xì)胞的早期表達(dá)升高,引起S1P1的表達(dá),直至胸腺細(xì)胞成熟遷出胸腺。項目組前期關(guān)于重癥肌無力（myasthenia gravis,MG）的研究發(fā)現(xiàn)在MG患者胸腺組織中轉(zhuǎn)錄因子FoxO1和S1P1在RNA水平和蛋白水平均高于正常對照組,提示FoxO1可能通過調(diào)節(jié)S1P1表達(dá)與MG的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。S1P/S... 

【文章來源】：鄭州大學(xué)河南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

胸腺細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞的FACS分析方法

圖 2.2 FoxO1-重組載體圖譜注：a：FoxO1-過表達(dá)載體圖譜；b：FoxO1-shRNA 載體圖譜2.2. 7.5 重組載體的擴增大腸桿菌感受態(tài) DH5α細(xì)胞的制備：受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化學(xué)試劑）的處理細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，能容許外源 DNA 的載體分子通過，稱為感受態(tài)細(xì)取 DH5α菌液 1ml 接種至含有 100ml LB 培養(yǎng)基的 500ml 燒瓶中，37℃（200-300r/min）2-3h 至 OD 值 0.5-0.6，無菌條件下把菌液倒入 50ml 離心管在 4℃下 4 100 r/min 離心 10 min。加入 bufferA 重懸，4℃下 4 100 r/min 離min，buffer B 重懸。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài) DH5α細(xì)胞：將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒加入裝有感受態(tài) DH5α管內(nèi)，冰上放置 30min，42浴熱激 30-60s，熱激后立即放置冰上 5min；加入 1ml LB 培養(yǎng)基，37℃，≤搖菌 1h；4000-5000r 離心 5min，殘留 20-30ul 上清，吹打搖勻，轉(zhuǎn)化菌涂氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行陽性克隆篩選，37℃培養(yǎng)過夜。

3 結(jié)果3.1 EAMG 鼠模型的鑒定6-8 周雌性 Lewis 大鼠經(jīng)過 AchR 多肽免疫，在第 3 次免疫后進(jìn)行功能評分，EAMG 鼠模型功能評分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，肌肉力量無異常；1 分，抓取無力，活動輕度減少，易疲勞；2 分，大鼠活動明顯減少，行走不穩(wěn)，休息時身體成隆起姿勢，頭尾下垂，前肢屈曲，震顫；3 分，大鼠嚴(yán)重全身無力，無抓取、撕咬動作，身體震顫，瀕死狀態(tài)；4 分：大鼠死亡。評分結(jié)果：0 分，2 只；1 分，13 只；2分，5 只；3 分，0 只；4 分，0 只。與對照組相比，EAMG 鼠模型伴隨著評分的升高，肌電波幅下降。選取評分為 1 分和 2 分的大鼠采眼眶血分離血清，ELISA法測抗 AchR 抗體，結(jié)果如圖 3.1 顯示 EAMG 組 OD 值明顯增高（EAMG 組0.97 ± 0.09，對照組 0.12± 0.01，P<0.05），且 ODEAMG組/OD對照組>2。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Foxo1-KLF2-S1P1在MG患者胸腺組織的表達(dá)[J]. 張云,趙俊濤,劉萍萍,軒小燕,朱鄭坤,馬瑩瑩,李倩如,杜英.  免疫學(xué)雜志. 2015(02)
[2]Involvement of Sphingosine 1-Phosphate （S1P） Receptor Type 1 and Type 4 in Migratory Response of Mouse T Cells toward S1P[J]. Hirofumi Matsuyuki,Yasuhiro Maeda,Kazuhiro Yano,Kunio Sugahara,Kenji Chiba,Takayuki Kohno,Yasuyuki Igarashi.  Cellular & Molecular Immunology. 2006(06)
[3]Role of Sphingosine 1-Phosphate Receptor Type 1 in Lymphocyte Egress from Secondary Lymphoid Tissues and Thymus[J]. Kenji Chiba,Hirofumi Matsuyuki,Yasuhiro Maeda,Kunio Sugahara.  Cellular & Molecular Immunology. 2006(01)



本文編號：2910339