研究背景谷氨酸在疼痛信息的感知、傳遞和調控中發(fā)揮了重要作用。研究證實,谷氨酸的過度釋放與神經病理性痛的發(fā)生發(fā)展密切相關。囊泡谷氨酸轉運體（vesicular glutamate transporters,VGLUTs）是突觸前負責將谷氨酸轉運到囊泡內的轉運體蛋白質,因此對以胞吐形式釋放的谷氨酸能神經遞質具有重要的調控作用。目前已知的VGLUTs包含三種亞型,其中2型囊泡谷氨酸轉運體（vesicular glutamate transporter 2,VGLUT2）主要分布于背根神經節(jié)（dorsal root ganglia,DRG）、脊髓、腦干和丘腦等與疼痛信號傳遞和加工密切相關的部位或區(qū)域。有文獻報道VGLUT2全身敲除雜合子小鼠的神經病理性疼痛癥狀消失或減弱,同時VGLUT2全身敲除純合子胎鼠丘腦神經元興奮性突觸后電流的幅度和頻率下降;條件性敲除DRG中VGLUT2導致小鼠熱痛覺過敏消失,但機械痛敏維持正常。以上研究提示,VGLUT2可能與疼痛,尤其是神經病理性痛有關,但在丘腦、脊髓及DRG中的作用有所差異。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),神經病理性痛引起脊髓和丘腦等疼痛相關腦區(qū)VGLUT2... 

【文章來源】：軍事科學院北京市

【文章頁數】：103 頁

【學位級別】：博士

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中文摘要
Abstract
前言
第一部分 神經痛模型動物脊髓VGLUT2表達變化
    1 實驗材料
    2 實驗方法
        2.1 試劑配方
        2.2 機械痛閾測定
        2.3 坐骨神經分支選擇性損傷（SNI）模型構建
        2.4 真核表達質粒pcDNA3.1/myc-His-VGLUT2構建
        2.5 PC12細胞轉染
        2.6 蛋白免疫印跡實驗
        2.7 免疫組化實驗
        2.8 組織免疫熒光雙重標記實驗
        2.9 定量和統(tǒng)計分析
    3 實驗結果
        3.1 VGLUT2抗體驗證
        3.2 SNI神經病理性痛模型的構建及驗證
        3.3 SNI術后不同時間點脊髓VGLUT2表達變化
    4 小結
第二部分 VGLUT2shRNA慢病毒對神經痛及谷氨酸釋放的影響
    1 實驗材料
    2 實驗方法
        2.1 試劑配方
        2.2 含GFP熒光標記的VGLUT2shRNA慢病毒載體構建
        2.3 表達VGLUT2shRNA的慢病毒載體包裝
        2.4 原代神經元培養(yǎng)
        2.5 細胞免疫熒光實驗
        2.6 原代培養(yǎng)神經元的病毒感染
        2.7 Real-timePCR和蛋白免疫印跡檢測原代培養(yǎng)神經元VGLUT2表達
        2.8 機械痛閾測定
        2.9 SNI模型構建
        2.10 鞘內注射VGLUT2shRNA慢病毒
        2.11 丘腦VPL腦區(qū)微量注射VGLUT2shRNA慢病毒
        2.12 原代培養(yǎng)神經元谷氨酸釋放實驗
        2.13 脊髓、丘腦突觸體谷氨酸釋放實驗
        2.14 定量和統(tǒng)計分析
    3 實驗結果
        3.1 VGLUT2shRNA重組慢病毒載體制備與篩選
        3.2 鞘內注射VGLUT2shRNA慢病毒對SNI小鼠機械痛閾的影響
        3.3 丘腦VPL腦區(qū)注射VGLUT2shRNA慢病毒對SNI小鼠機械痛閾的影響
        3.4 VGLUT2shRNA慢病毒對谷氨酸釋放的影響
    4 小結
第三部分 神經痛模型動物Wnt/β-catenin信號通路的變化及其在VGLUT2表達調控中的作用
    1 實驗材料
    2 實驗方法
        2.1 藥品配置
        2.2 機械痛閾測定
        2.3 SNI模型構建
        2.4 Real-timePCR檢測脊髓Wnt基因mRNA水平
        2.5 蛋白免疫印記檢測Wnt1、β-catenin蛋白表達
        2.6 鞘內注射VGLUT2shRNA慢病毒、XAV939、Wnt激動劑、Wnt1、BDNF
        2.7 定量和統(tǒng)計分析
    3 實驗結果
        3.1 小鼠SNI術后不同時間Wnt/β-catenin信號分子的表達變化
        3.2 Wnt/β-catenin信號通路對VGLUT1、VGLUT2蛋白表達的影響
        3.3 BDNF對VGLUT1、VGLUT2蛋白表達的影響
        3.4 Wnt/β-catenin信號通路介導的VGLUT2表達調控在神經痛中的作用
    4 小結
討論
結論
參考文獻
主要簡歷
致謝



本文編號：2910257