研究背景與研究目的卒中是世界范圍內導致死亡和殘疾的主要原因之一,最常見的是缺血性卒中。目前認為唯一有效的治療措施是時間窗內恢復血流,包括重組組織纖維蛋白溶酶源激活劑(recombinant tissue plasminogen activator,r-tPA)靜脈溶栓和機械取栓治療。但是狹窄的治療時間窗(4.5h內)和相對較高的顱內出血風險限制了r tPA的臨床應用。尤其是腦血流恢復后還可能進一步觸發(fā)腦缺血/再灌注(ischemia/reperflusion,I/R)損傷,因此神經(jīng)保護劑仍然被認為是治療缺血性卒中的更有效的方法。缺血性損傷,尤其是腦血流恢復后觸發(fā)的腦I/R損傷的病理生理機制非常復雜,包括能量代謝損害、谷氨酸或神經(jīng)毒素釋放、鈣離子超載、炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡和自噬。因此針對單一靶點的藥物或單純應用一種神經(jīng)保護劑不足以改善缺血性卒中的臨床預后。目前越來越多的證據(jù)表明:炎癥反應和自噬主要引起了腦I/R損傷的級聯(lián)性損害。腦I/R損傷的動物模型已經(jīng)證實調整腦內自噬過程可以改善其神經(jīng)功能損害。除此之外研究證實腦脊液中自噬水平與缺血性卒中的預后相關。因此以上證據(jù)提示我們靶向作用于炎癥和自噬過程的藥物可能是有效治療腦I/R損傷的有效措施。2013年美國心臟學會(American Heart Association,AHA)和美國卒中學會(American Stroke Association,ASA)聯(lián)合頒布的急性缺血性卒中早期管理指南中,首次推薦他汀類藥物做為神經(jīng)保護劑。他汀類藥物在腦I/R損傷的動物模型中通過減輕炎癥損傷、調節(jié)血栓形成、改善內皮功能、促進血管生成、減少氧化應激發(fā)揮神經(jīng)保護作用,這一點毫無爭議。但是臨床使用他汀類藥物對缺血性卒中患者的預后改善仍然存在爭論,究其原因可能是由于他汀使用的劑量和依從性導致,還可能是由于腦I/R損傷的復雜的病理生理機制引起的。另外,他汀類藥物在其他疾病中已被證實可以通過調節(jié)自噬來改善疾病的預后,比如帕金森病、缺血性和非缺血性心肌病變、脊髓損傷以及哮喘;然而,迄今為止,沒有任何證據(jù)可以證明他汀是否可以通過調整自噬過程來發(fā)揮對抗腦I/R損傷的神經(jīng)保護作用。因此以上這些提示我們作用于自噬過程的藥物可能會有效提高他汀對抗腦缺I/R損傷的神經(jīng)保護作用。沉默信息調節(jié)因子(silent information regulator,SIR)基因(sirtuins)是一組從古細菌到高等真核生物均高度保守的煙酰胺腺苷酸核酸(nieotimide adenosine dinueleotide,NAD)依賴的去乙�；�。廣泛存在于原核生物和真核生物中。在轉錄沉寂、信號轉導、染色質穩(wěn)定、雙鏈DNA斷裂損傷后生理修復等方面起重要作用,參與細胞周期、細胞凋亡、細胞分化及細胞壽命的調節(jié)。在所有的sirtuins中,SIRT1受到了最多的關注,它能夠調節(jié)許多重要的信號通路,包括DNA修復和細胞凋亡,肌肉和脂肪分化,神經(jīng)發(fā)生,線粒體生物發(fā)生,葡萄糖和胰島素穩(wěn)態(tài),激素分泌,細胞應激反應和晝夜節(jié)律。合成或者天然的SIRT1激活劑(sirtuin activating compounds,STACs)可以抑制腫瘤生長、減緩炎癥的發(fā)展、防治心血管疾病以及Ⅱ型糖尿病。在迄今為止發(fā)現(xiàn)的所有天然SIRT1激活劑中,白藜蘆醇(Resveratrol,RES)(3,5,4'-三羥基-二苯乙烯)是最有效的。RES被證實具有保護大鼠免受腦I/R損傷的神經(jīng)保護作用,其神經(jīng)保護作用涉及到以下幾種機制:抗炎、抗氧化應激、免疫調節(jié)和抗凋亡。更重要的是,RES被認為是天然的自噬調節(jié)劑。研究證實RES可以通過上調自噬水平緩解大鼠的腦I/R損傷。我們發(fā)現(xiàn)他汀類藥物和RES在對抗腦I/R損傷的神經(jīng)保護作用方面具有一些共同的通路。其中瑞舒伐他汀(Rosuvastatin,ROS)由于其低細胞毒性和多效性優(yōu)于其他類型的他汀類藥物,被廣泛推薦用于缺血性卒中的一級和二級預防治療。因此我們推測RES和ROS聯(lián)合治療可能具有協(xié)同對抗腦I/R損傷的神經(jīng)保護作用。在本研究中,我們使用大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)90分鐘后再灌注24小時作為腦I/R損傷的動物模型。我們試圖證實RES和ROS聯(lián)合預處理對大鼠腦I/R損傷具有協(xié)同的神經(jīng)保護作用,并探討其可能的機制。研究方法1.SPF級健康成年雄性Sprague Dawley大鼠60只,體重200-220g,接受暫時性MCAO手術作為腦I/R損傷的動物模型。大鼠被隨機分為4組(每組n = 15):MCAO模型對照組,單獨RES預處理組,單獨ROS預處理組,以及RES和ROS聯(lián)合預處理組。RES(50mg/kg)通過腹腔注射給藥,ROS(10mg/kg)通過灌胃給藥,對照組大鼠則給予等量的生理鹽水灌胃和二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)腹腔注射。所有的藥物治療均為每天一次,在腦缺血發(fā)生前連續(xù)給藥7天。2.再灌注24小時后,通過盲法檢查者使用修正的神經(jīng)學嚴重程度評分(modified neurological severity scores,mNSS)進行神經(jīng)功能學評估,并通過3,5-三苯基四氮挫氯化物(3,5-Triphenyltetrazoliumchloride,TTC)染色法測定局部梗死體積。3.再灌注24小時后,用Western Blot法檢測缺血側腦組織內凋亡相關蛋白(Bax,Bcl-2,caspase-3),促炎細胞因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)以及自噬相關蛋白(LC3Ⅱ,LC3Ⅰ和Becline-1)的表達水平。結果1.ROS聯(lián)合RES預處理對腦I/R損傷具有協(xié)同保護作用與對照組相比,單獨RES預處理、單獨ROS預處理以及ROS聯(lián)合RES預處理均能明顯降低腦I/R損傷引起的腦梗死體積和神經(jīng)功能學評分。更重要的是:ROS聯(lián)合RES預處理組大鼠的腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損評分比單獨RES預處理組或單獨ROS預處理組更低。而單獨RES預處理組和單獨ROS預處理組在腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損評分方面并無顯著性差異。這些結果提示缺血前ROS聯(lián)合RES預處理具有協(xié)同保護腦I/R損傷的能力。2.ROS聯(lián)合RES預處理在大鼠局灶性腦I/R損傷中具有協(xié)同抗凋亡作用我們發(fā)現(xiàn):與對照組相比,單獨RES預處理、單獨ROS預處理以及ROS聯(lián)合RES預處理均能顯著增加缺血側腦組織內Bcl-2的表達,并顯著降低Bax和caspase-3表達。更重要的是,與單獨RES預處理或單獨ROS預處理相比較,ROS聯(lián)合RES預處理能顯著增加缺血側腦組織內Bcl-2表達,并顯著降低Bax和caspase-3表達,而且聯(lián)合預處理能顯著增加缺血側腦組織內Bcl-2/Bax比率。然而單獨RES預處理和單獨ROS預處理在缺血側腦組織內Bc1-2,caspase-3和Bax的表達上無顯著性差異。因此,這些結果提示在大鼠局灶性腦I/R損傷中,缺血前ROS聯(lián)合RES預處理的協(xié)同保護作用可能與其協(xié)同抗凋亡作用相關。3.ROS聯(lián)合RES預處理在大鼠局灶性腦I/R損傷中具有協(xié)同抗炎作用我們western blot方法檢測缺血側腦組織內炎癥因子白介素-1β(IL-1β)的含量。結果提示:與對照組相比,單獨RES預處理、單獨ROS預處理以及ROS聯(lián)合RES預處理均能明顯降低缺血側腦組織內IL-1β含量。我們還發(fā)現(xiàn):與單獨RES預處理或單獨ROS預處理相比較,ROS聯(lián)合RES預處理能顯著降低缺血側腦組織內IL-1β含量。然而單獨RES預處理和單獨ROS預處理在缺血側腦組織內IL-1β的表達上無顯著區(qū)別。因此,這些結果提示在大鼠局灶性腦I/R損傷中,缺血前ROS聯(lián)合RES預處理的協(xié)同保護作用可能與其協(xié)同抗炎作用相關。4.ROS聯(lián)合RES預處理在大鼠局灶性腦I/R損傷中具有協(xié)同激活自噬的作用與對照組相比,單獨RES預處理、單獨ROS預處理以及ROS聯(lián)合RES預處理能明顯增加缺血側腦組織內Becline-1的表達和LC3I1/LC3I比率。更重要的是我們還發(fā)現(xiàn):與單獨RES預處理或單獨ROS預處理相比較,ROS聯(lián)合RES預處理能顯著增加缺血側腦組織內Becline-1的表達和LC3II/LC3I比率。然而單獨RES預處理和單獨ROS預處理組在缺血側腦組織內Becline-1的表達和LC3II/LC3I比率上無明顯區(qū)別。因此,這些結果提示在大鼠局灶性腦I/R損傷中,缺血前ROS聯(lián)合RES預處理的協(xié)同保護作用可能與其協(xié)同激活自噬相關。結論及意義:1.ROS可能通過增強自噬激活作為改善局灶性腦I/R損傷預后的潛在機制;2.ROS和RES聯(lián)合治療對于腦I/R損傷具有協(xié)同的神經(jīng)保護作用,可能通過抗凋亡、抗炎以及激活自噬等途徑來實現(xiàn)。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R743.3
【部分圖文】：

圖２：凋亡細胞死亡途徑??巨自噬（圖３）?［３８］。微自噬是指通過溶酶體膜內陷、突出和分離過程直接吞噬細??胞質成分，有降解長壽命蛋白和膜蛋白、通過消耗多余的膜來維持和調節(jié)膜穩(wěn)態(tài)??和溶酶體大小的作用［３９］。伴侶蛋白介導的自噬通過溶酶體伴侶蛋白熱休克組成型??蛋白?７０?（Ｈｓｃ７０）和溶酶體相關膜蛋白－２Ａ?（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｍｅｍｂｒａｎｅ?ｐｒｏｔｅｉｎ??２，ＬＡＭＰ－２Ａ），一種溶酶體膜受體來運輸未折疊的蛋白質。巨自噬通過自噬體發(fā)??生，雙膜結合的囊泡與溶酶體融合，隨后降解蛋白質［４Ｍ１］，其中巨自噬（以下簡??稱自嗤）是自唾最主要和最好的研究形式。??越來越多的證據(jù)表明自噬廣泛參與缺血性卒中引起的腦損傷。然而，關于自??噬在缺血性中風中的確切作用，似乎尚未達成共識。大量的體內和體外的研究表??明自噬在缺血性中風中有保護作用［４２，４３，４４］，亦有大量的研究表明了自噬在缺血性??中風中的不利影響［４ＭＭ７］。有學者分析關于自噬在腦缺血中的作用的以往研究，??［４８］??

?山東大學博士學位論文???作用；２、抑制自噬可以減輕腦損傷：Ｗａｎｇ＃［５１］發(fā)現(xiàn)３－ＭＡ處理后可減輕Ｉ／Ｒ期間??的自噬并減少線粒體功能的下降。２以％等［５２］發(fā)現(xiàn)腹腔注射褪黑素能通過對??ＭａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙＭｉｃｒｏａｕｔｏｈａ

用眼科剪在ＣＣＡ上剪一小的切口，根據(jù)大鼠的體重選擇合適的線栓，將線栓從切??口處插入，取下動脈夾，將線栓向ＩＣＡ方向插入，直到插入１６－２０毫米，感到阻??力時，將線栓用結扎線固定在ＣＣＡ上，并開始記時（圖４，?Ａ）。逐層縫合、并用??酒精棉球消毒皮膚縫合處。待大腦中動脈（ｍｉｄｄｌｅ?ｃｅｒｅｂｒａｌ?ａｒｔｅｒｙ，?ＭＣＡＯ）閉塞??９０ｍｉｎ后小心拔出線栓進行再灌注。在整個手術過程中，大鼠肛溫維持在３７±０．５°Ｃ。??２．３神經(jīng)功能缺損評分：??大鼠再灌注２４小時后，根據(jù)大鼠改良神經(jīng)功能缺損評分（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ??ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ?ｓｅｖｅｒｉｔｙ?ｓｃｏｒｅ，?ｍＮＳＳ），由盲檢者對大鼠進行神經(jīng)功能缺損的評估。??評分在０－］８分之間，分數(shù)越高，神經(jīng)系統(tǒng)功能損害越嚴重。造模成功的大鼠可出??現(xiàn)行走時向左側轉圈，右眼可出現(xiàn)Ｈｏｎｅｒ征（圖４，?Ｂ＆Ｃ）。有文獻報道，在缺血６??小時后，較低的ｍＮＳＳ評分（ｍＮＳＳ＜?３．５分）可能提示沒有梗死灶形成［Ｓ６］。因此??我們剔除了腦Ｉ／Ｒ損傷２４小時后ｍＮＳＳ＜４分及死亡的大鼠
【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 Maria Lalkovi?ová;Viera Danielisová;;Neuroprotection and antioxidants[J];Neural Regeneration Research;2016年06期

2 Xiao-ping Huang;Huang Ding;Jin-dong Lu;Ying-hong Tang;Bing-xiang Deng;Chang-qing Deng;;Autophagy in cerebral ischemia and the effects of traditional Chinese medicine[J];Journal of Integrative Medicine;2015年05期

3 Wenqi Chen;Yinyi Sun;Kangyong Liu;Xiaojiang Sun;;Autophagy: a double-edged sword for neuronal survival after cerebral ischemia[J];Neural Regeneration Research;2014年12期

4 王忠強;楊易;盧濤;羅盼;李婧;吳俊平;唐忠志;盧綺萍;段秋紅;;Protective Effect of Autophagy Inhibition on Ischemia-reperfusion-induced Injury of N2a Cells[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年06期

5 ;Neuronal autophagy in cerebral ischemia[J];Neuroscience Bulletin;2012年05期

本文編號：2884768