研究背景及目的:腦膠質(zhì)瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的原發(fā)性腫瘤,具有惡性程度高、治療困難、預后差、頻繁復發(fā)等特點。膠質(zhì)瘤的標準治療方法是以手術(shù)切除腫瘤,同時結(jié)合放療、化療等輔助治療的綜合治療方法。雖然膠質(zhì)瘤的診療技術(shù)不斷的進步與發(fā)展,但目前膠質(zhì)瘤的治療現(xiàn)狀仍不樂觀。膠質(zhì)瘤細胞具有高度的遷移和侵襲能力,常造成腫瘤細胞的廣泛侵襲,給膠質(zhì)瘤的治療帶來極大的困難。因此探討導致膠質(zhì)瘤細胞高遷移和高侵襲特性的分子機制,并研究相應的靶向藥物,已成為當前膠質(zhì)瘤治療中亟待解決的問題。近來的大量研究證據(jù)表明,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、進展有密切聯(lián)系,EMT是腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵生物學過程,腫瘤細胞發(fā)生EMT會導致腫瘤細胞遷移和侵襲能力的增加。而且,EMT還與腫瘤干細胞(CSCs)緊密聯(lián)系,而CSCs也是腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥、復發(fā)的重要原因,因此如能找到靶向膠質(zhì)瘤EMT的方法,不僅可以抑制膠質(zhì)瘤EMT,而且還可以調(diào)控膠質(zhì)瘤的干細胞性質(zhì),這無疑會給膠質(zhì)瘤的治療帶來新的突破。二甲雙胍是一種被廣泛應用的降糖藥物,白藜蘆醇是一種天然的多酚類化合物。近年來研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍和白藜蘆醇不僅可以發(fā)揮抗腫瘤效果,更重要的是可以調(diào)控腫瘤細胞的EMT過程。但這兩種藥物對膠質(zhì)瘤EMT過程的抑制作用,尚未見系統(tǒng)研究過。本研究旨在研究膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生EMT改變以及二甲雙胍和白藜蘆醇對膠質(zhì)瘤EMT改變的抑制作用及分子機制。方法:在本研究中,我們利用TGF-β1誘導膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生EMT改變,觀察EMT對膠質(zhì)瘤細胞生物學性能的影響,應用二甲雙胍和白藜蘆醇作為膠質(zhì)瘤EMT的干預藥物。通過免疫印跡、劃痕試驗、Transwell侵襲試驗、腫瘤球形成試驗等方法,分析和研究二甲雙胍和白藜蘆醇對膠質(zhì)瘤發(fā)生EMT的抑制作用以及對EMT獲得的腫瘤干細胞性能的調(diào)控作用,并探討可能的作用機制。結(jié)果:1.TGF-β1可以誘導膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)標志物的轉(zhuǎn)變,使細胞形態(tài)變得拉長、伸長,增加膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲能力,表明TGF-β1可以誘導膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生EMT改變,并建立誘導膠質(zhì)瘤EMT改變的模型。2.干擾轉(zhuǎn)錄因子ZEB1在膠質(zhì)瘤的表達,可抑制膠質(zhì)瘤細胞上皮間質(zhì)標志物的轉(zhuǎn)變,并抑制膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲,從而抑制膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生EMT。3.膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生EMT能增加膠質(zhì)瘤的自我更新能力、上調(diào)腫瘤干細胞標志物的表達,表明EMT可使膠質(zhì)瘤細胞獲得腫瘤干細胞的性質(zhì)。4.二甲雙胍和白藜蘆醇可以抑制膠質(zhì)瘤細胞上皮間質(zhì)標志物的表達,并抑制膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲能力,表明二甲雙胍和白藜蘆醇能抑制膠質(zhì)瘤發(fā)生EMT改變。5.二甲雙胍和白藜蘆醇分別通過抑制AKT/m TOR通路和Smad依賴通路抑制膠質(zhì)瘤EMT改變。6.二甲雙胍和白藜蘆醇能有效抑制膠質(zhì)瘤EMT獲得的細胞自我更新能力和干細胞標志物的表達,表明它們能抑制膠質(zhì)瘤EMT獲得的腫瘤干細胞性質(zhì)。結(jié)論:1.證明膠質(zhì)瘤LN18和U87細胞在一定條件下能發(fā)生EMT。2.ZEB1在膠質(zhì)瘤細胞EMT發(fā)生中起關(guān)鍵調(diào)控作用。3.膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生EMT可使膠質(zhì)瘤細胞獲得腫瘤干細胞性質(zhì)。4.二甲雙胍和白藜蘆醇能抑制膠質(zhì)瘤細胞EMT改變、抑制細胞的遷移和侵襲。5.二甲雙胍和白藜蘆醇分別通過抑制AKT/m TOR通路和Smad依賴通路抑制膠質(zhì)瘤細胞EMT 6.二甲雙胍和白藜蘆醇能抑制膠質(zhì)瘤EMT獲得的腫瘤干細胞性質(zhì)。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

圖 1.1 EMT 的分型[11]Figure1.1 Different types of EMT[11]1.2.3 EMT 的標志物EMT 的發(fā)生常伴隨多種上皮和間質(zhì)分子標志物的變化。發(fā)生 EMT 時，上皮分子標志物 E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達下調(diào)，而間質(zhì)分子標志物 N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纖維連接蛋白（fibronectin）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）等表達上調(diào)。E-鈣黏蛋白是細胞之間的重要黏附分子，EMT的特點之一是細胞間的黏附喪失和 E-鈣黏蛋白表達減少，E-鈣黏蛋白表達下調(diào)是 EMT 重要的標志性改變[12]。N-鈣黏蛋白也是 EMT 的重要間質(zhì)分子標志物，在上皮性腫瘤中 N-鈣黏蛋白表達的上調(diào)，往往導致細胞的遷移和侵襲能力增強。即 EMT 過程會出現(xiàn) E-鈣黏蛋白到 N-鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)換（E- to N-cadherinswitch），稱“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換（cadherin switch）”，已成為 EMT 廣泛使用的標

圖 1.2 EMT 涉及到的信號通路[50]Figure1.2 Signaling pathways involved in EMT[50]1.4.3 靶向與 EMT 有關(guān)的非編碼 RNAs某些微小 RNA（smicroRNAs, miRNAs）和長鏈非編碼 RNA（slong noncodingRNAs, lncRNAs）主要通過調(diào)節(jié) EMT 誘導轉(zhuǎn)錄因子或（和）EMT 信號通路的表達來調(diào)控 EMT[52,53]。miRNAs 能促進或阻遏 EMT 發(fā)生。如 miRNA-361-5p能調(diào)節(jié) Twist1 而抑制膠質(zhì)瘤細胞 EMT[54]。過表達的長鏈非編碼 RNA PTCSC3可以通過下調(diào) Wnt 信號通路抑制膠質(zhì)瘤 U87 細胞 EMT[55]。靶向與 EMT 有關(guān)的miRNAs 或長鏈非編碼 RNAs，已成為干預 EMT 的策略之一。1.4.4 靶向 EMT 標志物EMT 的特點是喪失上皮性標志物（如 E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白、細胞角蛋

圖 2.1 ZEB1 shRNA 質(zhì)粒圖譜Figure2.1 The plasmid profile of ZEB1 shRNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與擴增：（1）取 50 μl 大腸桿菌感受態(tài)細胞，按不同的分組分別加入適量 As（shZEB1-1 or shZEB1-2）和 Control shRNA（shCtrl）質(zhì)粒（體積 μl），混合均勻。（2）冰上孵育 30 min 后，42℃水浴鍋內(nèi)熱激 90 s，馬上放回冰上，（3）加入 400 μl 37℃的 LB 培養(yǎng)基，于 37℃ 搖床慢搖振蕩培養(yǎng) 45-6（4）取 的菌液涂在含有氨芐青霉素（50 μg/ml）的 LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。（5）利用無菌的槍尖挑選單個菌落，放入5 ml的 LB培養(yǎng)基中（含50
【參考文獻】

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1 Michael A Lea;Jacob Pourat;Rupali Patel;Charles desBordes;;Growth inhibition of colon cancer cells by compounds affecting AMPK activity[J];World Journal of Gastrointestinal Oncology;2014年07期

本文編號：2883383