研究背景及目的:吉蘭巴雷綜合征(Guillain-Barrésyndrome,GBS)是以周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system,PNS)的髓鞘脫失和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為特點(diǎn)的自身免疫性神經(jīng)病,表現(xiàn)為肢體對(duì)稱(chēng)性弛緩性癱瘓,累及呼吸肌可致死,部分患者遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(experimental autoimmune neuritis,EAN)是眾所周知的GBS的經(jīng)典動(dòng)物模型。輔助性T細(xì)胞(helper T cell,Th)其中的Th1/Th17細(xì)胞是實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(EAN)的炎癥和免疫過(guò)程的必要參與者。由于Th1/Th17細(xì)胞是促炎細(xì)胞并且都分泌促炎細(xì)胞因子,抑制Th1和Th17分化并減少炎癥因子的藥物將具有治療潛力。ZSTK474[2-(2-difluoromethylbenzimidazol-1-yl)-4,6-dimorpholino-1,3,5-triazine],I類(lèi)PI3K抑制劑,在癌癥、自身免疫性腦脊髓炎及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中被廣泛研究,具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的潛能。然而,ZSTK474對(duì)吉蘭-巴利綜合征(GBS)的潛在治療作用和精確機(jī)制尚不明確。迄今為止,多種應(yīng)用于GBS治療的可能藥物均在EAN動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證,但是ZSTK474在GBS中的作用及其機(jī)制目前尚未被探索。為了解決這一科學(xué)問(wèn)題,我們團(tuán)隊(duì)將ZSTK474應(yīng)用于EAN模型,在大鼠的臨床癥狀初發(fā)時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù),收集并整理相關(guān)數(shù)據(jù),包括臨床評(píng)分、炎細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘程度、肌電圖檢測(cè)結(jié)果、Th1/Th17表型的分布等;通過(guò)分析及評(píng)價(jià)PI3K抑制劑,ZSTK474,在GBS動(dòng)物模型上的療效,探討相關(guān)的信號(hào)通絡(luò),以期找到它發(fā)揮作用的機(jī)制。研究方法:我們通過(guò)皮下注射周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)抗原P0_(180-199)在Lewis大鼠中誘導(dǎo)EAN。將這些EAN大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和ZSTK474處理的治療組。記錄大鼠每日的臨床評(píng)分及體重,通過(guò)Mann-Whitney U檢驗(yàn)評(píng)估臨床評(píng)分以及電生理學(xué)和組織病理學(xué)變化。在疾病高峰期,通過(guò)大鼠坐骨神經(jīng)的肌電圖檢測(cè)結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)坐骨神經(jīng)損傷程度,主要評(píng)價(jià)指標(biāo)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(motor nerve conduction velocity,MNCV),誘發(fā)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(compound muscle action potential,CMAP)等,后者潛伏期及波幅,不僅能夠有利于診斷,還可以評(píng)估轉(zhuǎn)歸。之后,留取EAN大鼠的坐骨神經(jīng),進(jìn)行HE和快藍(lán)染色來(lái)評(píng)價(jià)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失程度,并通過(guò)免疫熒光技術(shù)來(lái)探索Th17細(xì)胞的變化;同時(shí)對(duì)坐骨神經(jīng)進(jìn)行蛋白提取,并通過(guò)蛋白印跡技術(shù)驗(yàn)證PI3K通路相關(guān)蛋白的改變。留取坐骨神經(jīng)的同時(shí),留取大鼠脾臟,來(lái)獲得單個(gè)核細(xì)胞(Mononuclear cell MNC),用來(lái)分析淋巴細(xì)胞增殖情況,通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析各種炎性因子的水平,進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4~+T細(xì)胞的變化。通過(guò)GraphPad Prism 5.0軟件分析統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)的差異,p0.05時(shí),代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.01,兩組間差異顯著。研究結(jié)果:1.ZSTK474處理后,與HPC處理后比較,前者能使EAN大鼠在疾病最嚴(yán)重時(shí)的分值下降,能減輕EAN大鼠周?chē)窠?jīng)損傷的嚴(yán)重程度。同時(shí)還減少了臨床運(yùn)動(dòng)缺損曲線(xiàn)的曲線(xiàn)下面積(p0.01)。與對(duì)照組相比,ZSTK474治療組具有更少的炎細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量(p0.01),更輕的髓鞘脫失(p0.05)。2.坐骨神經(jīng)肌電圖檢測(cè)結(jié)果顯示,治療組MNCV明顯增快(p0.01),CMAP波幅顯著增高(p0.05),潛伏期明顯縮短(p0.01)。3.流式細(xì)胞術(shù)分析脾單個(gè)核細(xì)胞結(jié)果表明,ZSTK474治療組Th1/Th17數(shù)量較對(duì)照組有明顯減少。說(shuō)明ZSTK474抑制Th細(xì)胞向Th1/Th17極化。P_(0180-199)刺激后,與對(duì)照組相比,ZSTK474治療組的降低了淋巴細(xì)胞的增殖,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有意義(p0.01)。4.應(yīng)用免疫熒光技術(shù)來(lái)了解Th17在神經(jīng)組織的浸潤(rùn)情況,結(jié)果表明,ZSTK474治療組相比對(duì)照組均顯示Th17細(xì)胞表型表達(dá)下降(p0.01),Western印跡分析顯示ZSTK474治療組p-STAT3表達(dá)下降(p0.01)。5.ELISA結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,ZSTK474治療組促炎癥因子(IL-1α,IL-1β,IFN-γand TNF-α)在蛋白水平上在表達(dá)量顯著下降,其他因子沒(méi)有顯著差異。RT-PCR在翻譯水平上也得到了同樣的結(jié)果,IFN-γ和TNF-α在治療組下降顯著,除此之外,IL-17和IL-23在治療組也顯著減少,表明ZSTK474對(duì)促炎因子具有抑制作用。6.Western印跡分析對(duì)于EAN大鼠坐骨神經(jīng)切片中p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K、和p-4E-BP1分析結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,ZSTK474治療組中p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K和p-4E-BP1表達(dá)均減少。研究結(jié)論:我們的研究結(jié)果表明ZSTK474有效減輕EAN的癥狀,該機(jī)制涉及PI3K/AKT/mTOR通路的抑制,從而影響Th1/Th17細(xì)胞的分化,進(jìn)一步減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。對(duì)ENA大鼠具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)保護(hù)作用。因此,ZSTK474可能作為治療GBS的一個(gè)候選藥物。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R745.43
【部分圖文】：

結(jié)果1 ZSTK474 改善 EAN 大鼠臨床癥狀，減輕 EAN 大鼠的組織學(xué)變化和減少炎癥細(xì)胞聚集1.1 ZSTK474 改善了 EAN 大鼠的臨床癥狀EAN 大鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組及 EAN 治療組（圖 1）。治療組是在免疫后第 7天左右（首次出現(xiàn)癥狀時(shí)）給予 ZSTK474，通過(guò)灌胃給予溶于 HPC 中的 ZSTK474（30mg / kg 體重/天）。對(duì)照組也是在免疫后約第 7 天（出現(xiàn)首發(fā)癥狀）后給載體 HPC，臨床評(píng)分不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，臨床評(píng)分的結(jié)果表明，在 ZSTK474 治療組，臨床評(píng)分低于對(duì)照組(每 1 組在每 1 個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別比較， p < 0.05，圖 1A)。對(duì)照組與 ZSTK474 治療組相比臨床評(píng)分的平均峰值顯著增高（HPC：7.25±0.1708;ZSTK474：4.5±0.2582; p <0.01，圖 1B), 此外，我們還觀察到了治療組與對(duì)照組相比 AUC 的降低（圖 1C; p <0.01）。與對(duì)照組相比較，ZSTK474 治療組減輕了EAN 大鼠的臨床神經(jīng)功能的缺損。

圖 2、EAN 大鼠的坐骨神經(jīng)的組織病理學(xué)檢測(cè)在免疫后的第 16 天，取出 EAN 大鼠的坐骨神經(jīng)用于 H＆E 染色（A）以評(píng)估炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和 LFB 染色（C）以觀察脫髓鞘。選擇每組的代表性顯微照片。A 中的箭頭指向炎癥細(xì)胞，C 中的箭頭表示脫髓鞘。每 mm2組織切片的炎癥細(xì)胞的平均數(shù)目顯示在 B 中。平均組織學(xué)評(píng)分顯示在 D 中。統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用 Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。A 和 C 中的比例尺為 10μm。結(jié)果表示為平均值±SEM（* p <0.05，** p <0.01 用于兩組之間的比較，n =每組 6 只大鼠/組用于臨床評(píng)分，n = 6 只大鼠/組用于染色）。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，獲得相似的結(jié)果。 HPC：對(duì)照組，ZSTK474：治療組。2 ZSTK474 減輕 EAN 誘導(dǎo)的周?chē)窠?jīng)損傷EAN 大鼠典型神經(jīng)生理學(xué)表現(xiàn)為：神經(jīng)傳到速遞減慢、復(fù)合動(dòng)作點(diǎn)位波幅下降及復(fù)合動(dòng)作點(diǎn)位潛伏期延長(zhǎng)。我們對(duì) EAN 大鼠進(jìn)行了腓腸肌和坐骨神經(jīng)的電生理檢查。結(jié)果表明， EAN 大鼠坐骨神經(jīng)的電生理顯示 ZSTK474 治療組具有下降的的 CMAP 幅度，增快的 MNCV 和縮短的 CMAP 潛伏期（圖 3A，B）。與對(duì)照組相比，MNCV 在治療組中顯著增快（HPC：38.27±1.915m / s ZSTK474：56.55±4.19m/s; p <0.01，圖 3C）。CMAP 幅度在治療組升高（HPC：10.88±1.482mV，

圖 3、ZSTK474 減輕了 EAN 誘導(dǎo)的周?chē)窠?jīng)損傷。圖 3A,B 顯示了運(yùn)動(dòng)神經(jīng) CMAP 的代表性肌電圖。 刺激位點(diǎn)是坐骨神經(jīng)的踝區(qū)域（A）或腓骨頭（B）。與對(duì)照組相比，ZSTK474 治療組顯示增加了 EAN 大鼠的平均 MNCV（C），增加了 CMAPs 的振幅（D）并且縮短了 CMAP 的遠(yuǎn)端運(yùn)動(dòng)潛伏期（E）。使用 Mann-WhitneyU 檢驗(yàn)比較對(duì)照組和 ZSTK474 治療組之間的差異。顯示的數(shù)據(jù)是平均值±SEM（* p <0.05，** p <0.01，每組 6 只大鼠用于對(duì)照和 ZSTK474 治療組之間的比較;）。 實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，獲得相似的結(jié)果。 HPC：對(duì)照組，ZSTK474：治療組; MNCV：運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度; CMAP：復(fù)合肌肉動(dòng)作電位。3 ZSTK474 抑制了 CD4+T 細(xì)胞的分化并抑制淋巴增殖反應(yīng)3.1ZSTK474 抑制了 CD4+T 細(xì)胞分化分化成 Th1 / Th17 細(xì)胞為了評(píng)估 ZSTK474 治療組對(duì) CD4+T 細(xì)胞分化的影響，如上所述，在疾病高峰期從大鼠的脾臟中分離 MNC。然后通過(guò)使用流式細(xì)胞術(shù)計(jì)算脾 MNC 中的CD4+T 細(xì)胞。與對(duì)照組相比，ZSTK474 治療組脾 MNC 中 Th1 CD4+IFN-γ+細(xì)胞（圖 4A，B）的百分比低于治療組（p <0.01）。此外，ZSTK474 處理降低了CD4+IL-17+Th17 細(xì)胞的百分比（圖 4E，F(xiàn)，p <0.05）。然而，與對(duì)照組相比，
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本文編號(hào)：2880506