發(fā)布時間：2020-11-10 04:31

　　 亨廷頓病(huntington's disease,HD)是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)退行性疾病,由編碼亨廷頓蛋白(huntingtin,Htt)的基因第一外顯子中CAG重復序列異常增多導致Htt氨基末端谷氨酰胺異常擴展。Htt在全身廣泛表達,但病理學上突變的Htt最早選擇性地引起紋狀體中等棘投射性神經(jīng)元(medium-size spiny projecting neurons,MSNs)死亡,隨著病程進展,其他腦區(qū)如大腦深層皮質、海馬、下丘腦等也受波及。纖維聯(lián)系上,紋狀體MSNs接受皮質神經(jīng)元的纖維投射,傳出纖維主要到達內外側蒼白球和黑質網(wǎng)狀部。HD早期癥狀與突觸功能異常有關。許多研究表明,突變Htt對突觸功能具有明顯毒性,如干擾突觸小泡的轉運,破壞突觸小泡的結構,抑制神經(jīng)遞質的攝取和釋放,影響突觸蛋白的表達或翻譯后修飾等。突觸小泡蛋白對突觸小泡功能的維持和調節(jié)十分重要,其表達和功能異常將影響突觸功能。突觸小泡蛋白2(synaptic vesicle protein 2,SV2)是一類跨膜糖蛋白,主要定位于神經(jīng)元突觸小泡和內分泌細胞分泌顆粒膜上。SV2家族有A、B、C三個亞型,其中SV2A和SV2B在腦內的分布較廣泛,SV2C的分布較局限,其表達腦區(qū)主要包括紋狀體、蒼白球、黑質、中腦、嗅球等舊腦區(qū)和海馬的CA3和齒狀回區(qū),與HD受累區(qū)域相似。SV2是影響突觸小泡或分泌顆粒釋放遞質或激素分泌的重要分子。敲除SV2A小鼠出現(xiàn)嚴重癲癇樣發(fā)作,腦片GABA遞質釋放大大減少;腎上腺髓質嗜鉻細胞儲存池分泌顆粒數(shù)目和大小不變,但準備釋放池明顯減小。干擾胰島β細胞和INS-1E(大鼠胰島素分泌細胞株)細胞內SV2A和SV2C,K~+刺激的胰島素分泌不減少,但高糖刺激下胰島素的分泌明顯減少,尤其以干擾SV2C時減少最為明顯。SV2氨基酸序列與細菌的轉運蛋白具有較高同源性,提示其可能是一類轉運蛋白。有研究認為,SV2可作為支架蛋白參與囊泡形狀的調節(jié)和轉運穩(wěn)定性的維持。但目前未見SV2是否參與突觸小泡或內分泌顆粒運輸?shù)膱蟮�。本研究首先檢測了突變Htt對SV2家族A、B、C三個亞型蛋白表達的影響,在觀察到突變Htt選擇性抑制SV2C亞型表達的基礎上,分析了SV2C在突觸小泡運輸中的作用及突變Htt影響SV2C表達的病理學意義。1.突變Htt選擇性抑制SV2C的表達已有研究證明,HD中的神經(jīng)病理損害與突變Htt通過轉錄水平干擾多種突觸小泡蛋白的表達有關。為了了解突變Htt是否通過影響SV2的表達而參與HD的發(fā)生,首先檢測了HD轉基因小鼠腦內SV2的表達。免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),在表達含82個谷氨酰胺重復序列的人Htt氨基末端171個氨基酸的N171-82Q HD轉基因(TG)小鼠腦內,SV2A水平在第16周有所增加,在第14周和第20周與野生型(WT)小鼠相近;SV2B在各期TG小鼠腦內無明顯變化,而SV2C在第14周TG小鼠腦內開始明顯減少,在第16周和第20周進一步降低。免疫組織化學染色顯示,TG小鼠各個腦區(qū)SV2A免疫反應性僅在第16周略有增強,SV2B免疫反應性無變化,而SV2C免疫反應性則在14~20周TG小鼠紋狀體、外側和內側蒼白球、黑質網(wǎng)狀部等腦區(qū)均顯著降低。RT-PCR檢測表明,3種SV2 mRNA表達水平的變化模式與其蛋白水平的變化模式十分相似。在轉染表達突變Htt(Htt-120Q)的N2a細胞(以轉染表達Htt-20Q的N2a細胞為對照)中,免疫印跡和RT-PCR分析進一步證明了突變Htt可明顯抑制SV2C的表達,輕度上調SV2A的表達,不影響SV2B的表達。以上結果表明,突變Htt主要選擇性抑制SV2C的表達。2.SV2C參與突觸小泡運輸SV2C在HD累及腦區(qū)高水平選擇性表達和突變Htt選擇性抑制SV2C的表達均提示,HD神經(jīng)病理學損害(如突觸功能障礙)可能與突變Htt通過抑制SV2C的表達而影響其功能有關。已知突變Htt對神經(jīng)元內物質運輸具有抑制作用,突觸小泡在神經(jīng)元內的正常運輸與正常突觸功能的維持關系密切。為了明確SV2C是否參與突觸小泡的運輸,首先檢測了SV2C在不同突觸小泡的定位特征,然后應用光漂白后熒光恢復(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)技術分析了沉默SV2C對神經(jīng)細胞內突觸小泡運輸?shù)挠绊�。在N2a細胞中分別轉染標記致密核心大突觸小泡的質粒pDsRed-NPY、標記小突觸小泡的質粒pEGFP-VAchT和標記大小兩種突觸小泡的質粒pEGFP-VAMP2,SV2C免疫熒光染色,激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示,SV2C在分化的N2a細胞中既分布在大突觸小泡上,也分布在小突觸小泡上。隨后用pEGFP-VAMP2和沉默SV2C的小干擾RNA質粒pmCherry-SV2C-siRNA共轉染N2a后,以FRAP技術分析顯示,與共轉染pEGFP-VAMP2和siRNA對照質粒的N2a細胞比較,沉默SV2C的細胞內EGFP-VAMP2標記的突觸小泡在漂白后熒光恢復的強度比和速率均顯著降低,即沉默SV2C后突觸小泡軸突轉運減弱,表明SV2C參與神經(jīng)細胞內大小突觸小泡的運輸。3.突變Htt通過下調SV2C表達抑制突觸小泡運輸為了證明突變Htt通過抑制SV2C的表達影響突觸小泡的細胞內運輸,檢測了上調SV2C表達是否可減弱突變Htt對細胞內突觸小泡運輸?shù)囊种啤?1)過表達SV2C顯著減弱突變Htt對突觸小泡運輸?shù)囊种?在N2a細胞中共轉染pmCherry-Htt-20Q和pEGFP-VAMP2或pmCherry-Htt160Q和pEGFP-VAMP2后進行FRAP檢測顯示,與表達正常Htt(mCherry-Htt-20Q)的細胞比較,表達突變Htt(pmCherry-Htt-160Q)的N2a細胞內EGFP-VAMP2標記的突觸小泡運輸明顯減慢。進一步在共轉染pEGFP-VAMP2、pmCherry-Htt-160Q和pCFP-SV2C或pEGFP-VAMP2、pmCherry-Htt-160Q和pCFP的N2a細胞中的FRAP觀察發(fā)現(xiàn),過表達SV2C可明顯減輕突變Htt對EGFP-VAMP2標記的突觸小泡運輸?shù)囊种啤?2)丁酸鈉減弱突變Htt對SV2C轉錄的下調并改善突變Htt對突觸小泡運輸?shù)囊种?本實驗室另有研究證明,阻遏子元件沉默轉錄因子(repressor element silencing transcription factor,REST)是SV2C的轉錄抑制因子。組蛋白去乙�；�1/2(histone deacetylase1/2,HDAC1/2)通過促進REST的作用負性調控相應靶基因的轉錄,突變Htt對HDAC活性具有促進作用。為了檢驗突變Htt是否通過促進HDAC活性抑制SV2C的表達,檢測了HDAC1/2選擇性抑制劑丁酸鈉對SV2C基因轉錄表達的影響。應用不同濃度(10~100μmol/L)的丁酸鈉處理轉染表達突變Htt的N2a細胞后免疫印跡和RT-PCR分析顯示,20~30μmol/L丁酸鈉能顯著抑制突變Htt對SV2C mRNA和蛋白的下調作用,較低(10μmol/L)或更高(50~100μmol/L)濃度的丁酸鈉則無明顯作用。由此可見,合適濃度的丁酸鈉可在一定程度上糾正突變Htt對SV2C基因的轉錄抑制作用。為了進一步證明突變Htt通過抑制SV2C的表達而影響突觸小泡的運輸,繼而分析了丁酸鈉對突變Htt抑制突觸小泡運輸效應的影響。FRAP檢測發(fā)現(xiàn),在共轉染表達EGFP-VAMP2和mCherry-Htt-160Q的N2a細胞中,30μmol/L丁酸鈉處理能明顯緩解突變Htt對EGFP-VAMP2標記的突觸小泡運輸?shù)囊种�。結論:突變Htt可選擇性抑制突觸小泡蛋白2C(SV2C)的轉錄表達;SV2C參與神經(jīng)細胞內突觸小泡的運輸;突變Htt可通過促進對阻遏子元件沉默轉錄因子(REST)活性具有激活作用的組蛋白去乙�；�1/2(HDAC1/2)的活性,抑制SV2C的轉錄表達和突觸小泡的運輸。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R742.2
【部分圖文】：

結 果1.突變Htt選擇性抑制SV2C的表達 已知突變Htt 可通過干擾多種突觸小泡蛋白的表達損害突觸功能，SV2 作為突觸小泡表面的高豐度膜蛋白，功能重要，三個亞型蛋白在腦內的分布各有其特點，那么突變 Htt 是否通過影響 SV2 的表達而參與 HD 的發(fā)生？為了弄清這一問題，首先檢測 HD 轉基因小鼠（TG 鼠）腦內 SV2 的表達有無改變。分別取第 14 周、第 16 周和第 20 周的正常野生型（wildtype，WT）小鼠和 TG 小鼠，代表疾病的早期、中期和晚期，應用免疫印跡技術檢測 SV2 腦蛋白表達的變化。發(fā)現(xiàn)：與 WT 小鼠比較，TG 小鼠腦內 SV2A 蛋白水平在第 16 周有所增加，在第 14 周和第 20 周與 WT 小鼠相近；SV2B 蛋白的表達在 TG 小鼠腦內無明顯變化；而 SV2C 蛋白表達在第 14 周 TG 小鼠腦內開始明顯減少，在第 16 周和第 20 周進一步降低。（圖 1）。

圖 2.TG鼠腦紋狀體、黑質和海馬SV2A水平免疫組織化學檢測，顯示其免疫反應性廣泛性增強。Str-LGP，紋狀體-外側蒼白球；SN，黑質；Hipp，海馬；比例尺，100 μm。圖 3. TG 鼠腦紋狀體和海馬 SV2B 水平免疫組織化學檢測，顯示其免疫反應性不變。

21 3. TG 鼠腦紋狀體和海馬 SV2B 水平免疫組織化學檢測，顯示其免疫反應性P，紋狀體-外側蒼白球；Hipp，海馬；比例尺，100 μm。圖 4. TG 鼠腦紋狀體、黑質和海馬 SV2C 水平的免疫組織化學檢測，顯示降低。Str-LGP，紋狀體-外側蒼白球；SN，黑質；Hipp，海馬；比例尺，10
【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 胡人義,范淑榮;突觸小泡膜表面突起的研究[J];解剖科學進展;1998年03期

2 ;關于“突觸小泡”和“神經(jīng)遞質”的討論[J];中學生物教學;2013年Z1期

3 葉方寅;突觸小泡轉運受體的Syntaxin家族[J];國外醫(yī)學(分子生物學分冊);1994年04期

4 鞠躬,舒斯云,魏正乾,李學榮,周扣珍,朱光明,包春杰;突觸小泡與突觸結內管狀結構的關系[J];第四軍醫(yī)大學學報;1982年04期

5 徐曉虹,吳馥梅;突觸小泡膜蛋白—SB蛋白的若干研究進展[J];細胞生物學雜志;1997年03期

6 胡人義,范淑榮;突觸小泡的生物學特性[J];針刺研究;1979年04期

7 胡人義;范淑榮;;大白鼠視上核內軸突終末內的突觸小泡與內質網(wǎng)的關系[J];解剖學報;1981年02期

8 吳馥梅,徐曉虹,強梅;突觸小泡膜蛋白與神經(jīng)遞質釋放的局部調節(jié)[J];生物化學與生物物理進展;1997年03期

9 劉祚周;神經(jīng)突觸前遞質小泡胞吐作用的分子機制[J];第三軍醫(yī)大學學報;2004年03期

10 王甫榮;夏祥斌;;神經(jīng)遞質只存在于突觸小泡中嗎?——對人教版高中《生物·必修3·穩(wěn)態(tài)與環(huán)境》的討論[J];中學生物教學;2015年11期

相關博士學位論文 前1條

1 彭超華;突變亨廷頓蛋白抑制突觸小泡蛋白2C表達和突觸小泡運輸[D];華中科技大學;2018年

本文編號：2877480