亨廷頓病(huntington's disease,HD)是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)退行性疾病,由編碼亨廷頓蛋白(huntingtin,Htt)的基因第一外顯子中CAG重復(fù)序列異常增多導(dǎo)致Htt氨基末端谷氨酰胺異常擴(kuò)展。Htt在全身廣泛表達(dá),但病理學(xué)上突變的Htt最早選擇性地引起紋狀體中等棘投射性神經(jīng)元(medium-size spiny projecting neurons,MSNs)死亡,隨著病程進(jìn)展,其他腦區(qū)如大腦深層皮質(zhì)、海馬、下丘腦等也受波及。纖維聯(lián)系上,紋狀體MSNs接受皮質(zhì)神經(jīng)元的纖維投射,傳出纖維主要到達(dá)內(nèi)外側(cè)蒼白球和黑質(zhì)網(wǎng)狀部。HD早期癥狀與突觸功能異常有關(guān)。許多研究表明,突變Htt對(duì)突觸功能具有明顯毒性,如干擾突觸小泡的轉(zhuǎn)運(yùn),破壞突觸小泡的結(jié)構(gòu),抑制神經(jīng)遞質(zhì)的攝取和釋放,影響突觸蛋白的表達(dá)或翻譯后修飾等。突觸小泡蛋白對(duì)突觸小泡功能的維持和調(diào)節(jié)十分重要,其表達(dá)和功能異常將影響突觸功能。突觸小泡蛋白2(synaptic vesicle protein 2,SV2)是一類(lèi)跨膜糖蛋白,主要定位于神經(jīng)元突觸小泡和內(nèi)分泌細(xì)胞分泌顆粒膜上。SV2家族有A、B、C三個(gè)亞型,其中SV2A和SV2B在腦內(nèi)的分布較廣泛,SV2C的分布較局限,其表達(dá)腦區(qū)主要包括紋狀體、蒼白球、黑質(zhì)、中腦、嗅球等舊腦區(qū)和海馬的CA3和齒狀回區(qū),與HD受累區(qū)域相似。SV2是影響突觸小泡或分泌顆粒釋放遞質(zhì)或激素分泌的重要分子。敲除SV2A小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重癲癇樣發(fā)作,腦片GABA遞質(zhì)釋放大大減少;腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞儲(chǔ)存池分泌顆粒數(shù)目和大小不變,但準(zhǔn)備釋放池明顯減小。干擾胰島β細(xì)胞和INS-1E(大鼠胰島素分泌細(xì)胞株)細(xì)胞內(nèi)SV2A和SV2C,K~+刺激的胰島素分泌不減少,但高糖刺激下胰島素的分泌明顯減少,尤其以干擾SV2C時(shí)減少最為明顯。SV2氨基酸序列與細(xì)菌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有較高同源性,提示其可能是一類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。有研究認(rèn)為,SV2可作為支架蛋白參與囊泡形狀的調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)穩(wěn)定性的維持。但目前未見(jiàn)SV2是否參與突觸小泡或內(nèi)分泌顆粒運(yùn)輸?shù)膱?bào)道。本研究首先檢測(cè)了突變Htt對(duì)SV2家族A、B、C三個(gè)亞型蛋白表達(dá)的影響,在觀察到突變Htt選擇性抑制SV2C亞型表達(dá)的基礎(chǔ)上,分析了SV2C在突觸小泡運(yùn)輸中的作用及突變Htt影響SV2C表達(dá)的病理學(xué)意義。1.突變Htt選擇性抑制SV2C的表達(dá)已有研究證明,HD中的神經(jīng)病理?yè)p害與突變Htt通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平干擾多種突觸小泡蛋白的表達(dá)有關(guān)。為了了解突變Htt是否通過(guò)影響SV2的表達(dá)而參與HD的發(fā)生,首先檢測(cè)了HD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)SV2的表達(dá)。免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在表達(dá)含82個(gè)谷氨酰胺重復(fù)序列的人Htt氨基末端171個(gè)氨基酸的N171-82Q HD轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠腦內(nèi),SV2A水平在第16周有所增加,在第14周和第20周與野生型(WT)小鼠相近;SV2B在各期TG小鼠腦內(nèi)無(wú)明顯變化,而SV2C在第14周TG小鼠腦內(nèi)開(kāi)始明顯減少,在第16周和第20周進(jìn)一步降低。免疫組織化學(xué)染色顯示,TG小鼠各個(gè)腦區(qū)SV2A免疫反應(yīng)性僅在第16周略有增強(qiáng),SV2B免疫反應(yīng)性無(wú)變化,而SV2C免疫反應(yīng)性則在14~20周TG小鼠紋狀體、外側(cè)和內(nèi)側(cè)蒼白球、黑質(zhì)網(wǎng)狀部等腦區(qū)均顯著降低。RT-PCR檢測(cè)表明,3種SV2 mRNA表達(dá)水平的變化模式與其蛋白水平的變化模式十分相似。在轉(zhuǎn)染表達(dá)突變Htt(Htt-120Q)的N2a細(xì)胞(以轉(zhuǎn)染表達(dá)Htt-20Q的N2a細(xì)胞為對(duì)照)中,免疫印跡和RT-PCR分析進(jìn)一步證明了突變Htt可明顯抑制SV2C的表達(dá),輕度上調(diào)SV2A的表達(dá),不影響SV2B的表達(dá)。以上結(jié)果表明,突變Htt主要選擇性抑制SV2C的表達(dá)。2.SV2C參與突觸小泡運(yùn)輸SV2C在HD累及腦區(qū)高水平選擇性表達(dá)和突變Htt選擇性抑制SV2C的表達(dá)均提示,HD神經(jīng)病理學(xué)損害(如突觸功能障礙)可能與突變Htt通過(guò)抑制SV2C的表達(dá)而影響其功能有關(guān)。已知突變Htt對(duì)神經(jīng)元內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸具有抑制作用,突觸小泡在神經(jīng)元內(nèi)的正常運(yùn)輸與正常突觸功能的維持關(guān)系密切。為了明確SV2C是否參與突觸小泡的運(yùn)輸,首先檢測(cè)了SV2C在不同突觸小泡的定位特征,然后應(yīng)用光漂白后熒光恢復(fù)(fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)技術(shù)分析了沉默SV2C對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)突觸小泡運(yùn)輸?shù)挠绊�。在N2a細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染標(biāo)記致密核心大突觸小泡的質(zhì)粒pDsRed-NPY、標(biāo)記小突觸小泡的質(zhì)粒pEGFP-VAchT和標(biāo)記大小兩種突觸小泡的質(zhì)粒pEGFP-VAMP2,SV2C免疫熒光染色,激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示,SV2C在分化的N2a細(xì)胞中既分布在大突觸小泡上,也分布在小突觸小泡上。隨后用pEGFP-VAMP2和沉默SV2C的小干擾RNA質(zhì)粒pmCherry-SV2C-siRNA共轉(zhuǎn)染N2a后,以FRAP技術(shù)分析顯示,與共轉(zhuǎn)染pEGFP-VAMP2和siRNA對(duì)照質(zhì)粒的N2a細(xì)胞比較,沉默SV2C的細(xì)胞內(nèi)EGFP-VAMP2標(biāo)記的突觸小泡在漂白后熒光恢復(fù)的強(qiáng)度比和速率均顯著降低,即沉默SV2C后突觸小泡軸突轉(zhuǎn)運(yùn)減弱,表明SV2C參與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)大小突觸小泡的運(yùn)輸。3.突變Htt通過(guò)下調(diào)SV2C表達(dá)抑制突觸小泡運(yùn)輸為了證明突變Htt通過(guò)抑制SV2C的表達(dá)影響突觸小泡的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸,檢測(cè)了上調(diào)SV2C表達(dá)是否可減弱突變Htt對(duì)細(xì)胞內(nèi)突觸小泡運(yùn)輸?shù)囊种啤?1)過(guò)表達(dá)SV2C顯著減弱突變Htt對(duì)突觸小泡運(yùn)輸?shù)囊种?在N2a細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pmCherry-Htt-20Q和pEGFP-VAMP2或pmCherry-Htt160Q和pEGFP-VAMP2后進(jìn)行FRAP檢測(cè)顯示,與表達(dá)正常Htt(mCherry-Htt-20Q)的細(xì)胞比較,表達(dá)突變Htt(pmCherry-Htt-160Q)的N2a細(xì)胞內(nèi)EGFP-VAMP2標(biāo)記的突觸小泡運(yùn)輸明顯減慢。進(jìn)一步在共轉(zhuǎn)染pEGFP-VAMP2、pmCherry-Htt-160Q和pCFP-SV2C或pEGFP-VAMP2、pmCherry-Htt-160Q和pCFP的N2a細(xì)胞中的FRAP觀察發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)SV2C可明顯減輕突變Htt對(duì)EGFP-VAMP2標(biāo)記的突觸小泡運(yùn)輸?shù)囊种啤?2)丁酸鈉減弱突變Htt對(duì)SV2C轉(zhuǎn)錄的下調(diào)并改善突變Htt對(duì)突觸小泡運(yùn)輸?shù)囊种?本實(shí)驗(yàn)室另有研究證明,阻遏子元件沉默轉(zhuǎn)錄因子(repressor element silencing transcription factor,REST)是SV2C的轉(zhuǎn)錄抑制因子。組蛋白去乙�；�1/2(histone deacetylase1/2,HDAC1/2)通過(guò)促進(jìn)REST的作用負(fù)性調(diào)控相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄,突變Htt對(duì)HDAC活性具有促進(jìn)作用。為了檢驗(yàn)突變Htt是否通過(guò)促進(jìn)HDAC活性抑制SV2C的表達(dá),檢測(cè)了HDAC1/2選擇性抑制劑丁酸鈉對(duì)SV2C基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響。應(yīng)用不同濃度(10~100μmol/L)的丁酸鈉處理轉(zhuǎn)染表達(dá)突變Htt的N2a細(xì)胞后免疫印跡和RT-PCR分析顯示,20~30μmol/L丁酸鈉能顯著抑制突變Htt對(duì)SV2C mRNA和蛋白的下調(diào)作用,較低(10μmol/L)或更高(50~100μmol/L)濃度的丁酸鈉則無(wú)明顯作用。由此可見(jiàn),合適濃度的丁酸鈉可在一定程度上糾正突變Htt對(duì)SV2C基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用。為了進(jìn)一步證明突變Htt通過(guò)抑制SV2C的表達(dá)而影響突觸小泡的運(yùn)輸,繼而分析了丁酸鈉對(duì)突變Htt抑制突觸小泡運(yùn)輸效應(yīng)的影響。FRAP檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在共轉(zhuǎn)染表達(dá)EGFP-VAMP2和mCherry-Htt-160Q的N2a細(xì)胞中,30μmol/L丁酸鈉處理能明顯緩解突變Htt對(duì)EGFP-VAMP2標(biāo)記的突觸小泡運(yùn)輸?shù)囊种�。結(jié)論:突變Htt可選擇性抑制突觸小泡蛋白2C(SV2C)的轉(zhuǎn)錄表達(dá);SV2C參與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)突觸小泡的運(yùn)輸;突變Htt可通過(guò)促進(jìn)對(duì)阻遏子元件沉默轉(zhuǎn)錄因子(REST)活性具有激活作用的組蛋白去乙�；�1/2(HDAC1/2)的活性,抑制SV2C的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和突觸小泡的運(yùn)輸。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R742.2
【部分圖文】：

結(jié) 果1.突變Htt選擇性抑制SV2C的表達(dá) 已知突變Htt 可通過(guò)干擾多種突觸小泡蛋白的表達(dá)損害突觸功能，SV2 作為突觸小泡表面的高豐度膜蛋白，功能重要，三個(gè)亞型蛋白在腦內(nèi)的分布各有其特點(diǎn)，那么突變 Htt 是否通過(guò)影響 SV2 的表達(dá)而參與 HD 的發(fā)生？為了弄清這一問(wèn)題，首先檢測(cè) HD 轉(zhuǎn)基因小鼠（TG 鼠）腦內(nèi) SV2 的表達(dá)有無(wú)改變。分別取第 14 周、第 16 周和第 20 周的正常野生型（wildtype，WT）小鼠和 TG 小鼠，代表疾病的早期、中期和晚期，應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測(cè) SV2 腦蛋白表達(dá)的變化。發(fā)現(xiàn)：與 WT 小鼠比較，TG 小鼠腦內(nèi) SV2A 蛋白水平在第 16 周有所增加，在第 14 周和第 20 周與 WT 小鼠相近；SV2B 蛋白的表達(dá)在 TG 小鼠腦內(nèi)無(wú)明顯變化；而 SV2C 蛋白表達(dá)在第 14 周 TG 小鼠腦內(nèi)開(kāi)始明顯減少，在第 16 周和第 20 周進(jìn)一步降低。（圖 1）。

圖 2.TG鼠腦紋狀體、黑質(zhì)和海馬SV2A水平免疫組織化學(xué)檢測(cè)，顯示其免疫反應(yīng)性廣泛性增強(qiáng)。Str-LGP，紋狀體-外側(cè)蒼白球；SN，黑質(zhì)；Hipp，海馬；比例尺，100 μm。圖 3. TG 鼠腦紋狀體和海馬 SV2B 水平免疫組織化學(xué)檢測(cè)，顯示其免疫反應(yīng)性不變。

21 3. TG 鼠腦紋狀體和海馬 SV2B 水平免疫組織化學(xué)檢測(cè)，顯示其免疫反應(yīng)性P，紋狀體-外側(cè)蒼白球；Hipp，海馬；比例尺，100 μm。圖 4. TG 鼠腦紋狀體、黑質(zhì)和海馬 SV2C 水平的免疫組織化學(xué)檢測(cè)，顯示降低。Str-LGP，紋狀體-外側(cè)蒼白球；SN，黑質(zhì)；Hipp，海馬；比例尺，10
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2 ;關(guān)于“突觸小泡”和“神經(jīng)遞質(zhì)”的討論[J];中學(xué)生物教學(xué);2013年Z1期

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4 鞠躬,舒斯云,魏正乾,李學(xué)榮,周扣珍,朱光明,包春杰;突觸小泡與突觸結(jié)內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)的關(guān)系[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1982年04期

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本文編號(hào)：2877480