研究目的:視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(Neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD)是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)特發(fā)性炎性脫髓鞘性自身免疫性疾病,主要累及視神經(jīng)和脊髓,有時累及腦部,多數(shù)由水通道蛋白4(Aquaporin 4,AQP4)抗體(AQP4-IgG)介導(dǎo)。AQP4是一種廣泛表達(dá)的膜蛋白,不僅表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上,也表達(dá)在外周多個器官中;AQP4-IgG不僅存在于腦脊液中,也存在于循環(huán)血液中,而且循環(huán)血液中的AQP4-IgG滴度更高;但是NMOSD主要選擇性地累及中樞神經(jīng)系統(tǒng),而外周器官很少受累,NMOSD這種中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性病灶形成的原因尚不清楚。CD59是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)低表達(dá)而外周器官高表達(dá)的補體調(diào)節(jié)蛋白,其表達(dá)豐度會影響補體依賴的膜攻擊復(fù)合物的形成。本課題的研究目的在于探索中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的CD59低表達(dá)是否參與了NMOSD中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性病灶的形成。研究方法:采取免疫熒光染色的方法對比人和小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官的AQP4和CD59的表達(dá)情況。采用慢病毒為載體使小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞CD59過表達(dá),然后小鼠腦內(nèi)注射NMO病人血漿IgG(Immunoglobulin G isolated from NMO patient serum,IgG_(NMO))和人補體誘導(dǎo)NMOSD樣病灶形成。利用AQP4、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、髓鞘堿性蛋白(Myelin basic protein,MBP)、CD45、離子鈣接頭分子(Ionized calcium bindingadaptor molecule-1,Iba-1)和C5b-9免疫染色比較CD59過表達(dá)對病灶的影響。體外培養(yǎng)小鼠的胃組織和骨骼肌細(xì)胞、人的骨骼肌細(xì)胞和氣管上皮細(xì)胞,利用慢病毒為載體向細(xì)胞轉(zhuǎn)染短發(fā)卡核糖核酸(Short hairpin ribonucleic acid,shRNA)敲低細(xì)胞CD59或者中和性抗體阻斷細(xì)胞或胃組織CD59的功能,然后向培養(yǎng)基中加入IgG_(NMO)和人補體。采用活死細(xì)胞染色和C5b-9免疫熒光染色評價CD59功能失活后的補體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(Complement-dependent cytotoxicity,CDC)。結(jié)果:CD59在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上幾乎不表達(dá),在外周器官上廣泛表達(dá)并與AQP4共定位。小鼠腦內(nèi)CD59過表達(dá)后,IgG_(NMO)和補體產(chǎn)生的AQP4、GFAP、MBP丟失和C5b-9減少,CD45和IBA1陽性面積減少。小鼠胃組織和骨骼肌細(xì)胞以及人骨骼肌細(xì)胞和氣管上皮細(xì)胞的CD59失活后,IgG_(NMO)和人補體的細(xì)胞毒性減少,C5b-9陽性顆粒減少。結(jié)論:CD59在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)極低,在外周器官表達(dá)AQP4的細(xì)胞上廣泛表達(dá)。CD59過表達(dá)可以減小小鼠腦內(nèi)NMO樣病灶,外周器官組織和細(xì)胞CD59失活增加AQP4抗體和補體介導(dǎo)細(xì)胞毒性。提示星形膠質(zhì)細(xì)胞CD59低表達(dá)可能參與了NMOSD中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性病灶的形成,腦內(nèi)CD59過表達(dá)有可能成為NMOSD治療的新方法。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R744.52
【部分圖文】：

23圖 1 CD59 在周圍器官 AQP4 陽性細(xì)胞上高表達(dá)，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)。（A）CD59（紅色）在人骨骼肌、腎臟、小腸和支氣管 AQP4 陽性細(xì)胞區(qū)域（綠色）高表達(dá)，在人腦內(nèi) GFAP（綠色）和 AQP4（綠色）陽性區(qū)域不表達(dá)。箭頭示陽性區(qū)域，標(biāo)尺=100μm.（B）WesternBlot 檢測小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周各器官的 CD59 表達(dá)量。β-actin 為內(nèi)參。（C）CD59（紅色）在小鼠骨骼肌、腎、胃和小腸內(nèi) AQP4（綠色）陽性區(qū)域高表達(dá)，在大腦和脊髓內(nèi) GFAP（綠色）與 AQP4（綠色）的陽性區(qū)域不表達(dá)。箭頭示陽性區(qū)域，標(biāo)尺=50μm人和小鼠體內(nèi) AQP4 與 CD59 的表達(dá)關(guān)系，我們用表格的形式加以總結(jié)（表1），從表格中我們可以看出在外周各器官中，表達(dá) AQP4 的組織同時表達(dá) CD59，而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足僅表達(dá) AQP4 但不表達(dá) CD59。

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 實驗結(jié)果27圖3 小鼠腦內(nèi)CD59過表達(dá)能夠減小NMOSD病灶。小鼠腦內(nèi)注射10 μl對照慢病毒或CD59過表達(dá)慢病毒 3 天后，分別注射 6 μl IgGcon或 IgGNMO加 4 μl 人補體的混合物，7 天后處死小鼠取腦做病理染色。其分組具體為：○1 對照病毒組小鼠注射 IgGNMO和人補體（ Conlenti+IgGNMO+hC ）； ○2 CD59 過 表 達(dá) 組 小 鼠 注 射 IgGNMO和 人 補 體（CD59lenti+IgGNMO+hC）；○3 對照病毒組小鼠注射 IgGcon和人補體（Conlenti+IgGcon+hC）（A）三組小鼠鼠腦注射點附近的 AQP4 染色、GFAP 染色、MBP 染色，標(biāo)尺=1mm。（B）A 圖中3 組小鼠統(tǒng)計出的 GFAP 染色、AQP4 染色和 MBP 染色的丟失面積（mean ±S.E. n = 5）。（C）A 圖中 Conlenti+IgGNMO+hC 組的病灶側(cè)和對側(cè)的放大圖。標(biāo)尺=100μm。IgGcon+hC 注射組相比，IgGNMO+hC 注射組小鼠鼠腦注射點附近區(qū)域的 AQP4、GFAP、MBP 丟失非常明顯（P<0.001），星形膠質(zhì)細(xì)胞破壞和髓鞘脫失嚴(yán)重，證實了我們的 IgGNMO+hC 鼠腦注射造模方法的可靠性，其病灶側(cè)和對側(cè)細(xì)節(jié)進(jìn)一步展示在放大圖中（圖 3C）：GFAP 染色可見對側(cè)的星形膠質(zhì)細(xì)胞未活化，病灶側(cè)核心區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞完全脫失

36圖 9 人體外周表達(dá) AQP4 的器官的組織細(xì)胞上的 CD59 能夠增加 AQP4-IgG 和補體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。人原代氣道上皮細(xì)胞（HTEpiC）（A-D）CD59 沉默慢病毒（CD59-RNAi）或?qū)φ詹《靖腥?3 天后（A 和 B）或者 CD59 中和性抗體 Bric229 或?qū)φ湛贵w孵育半小時后（C 和
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