發(fā)布時(shí)間：2020-11-06 11:34

　　 研究背景與目的:腦缺血性損傷會(huì)導(dǎo)致腦微血管結(jié)構(gòu)和功能的障礙,影響腦損傷的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞作為腦微循環(huán)的重要組成部分,在缺血缺氧時(shí)會(huì)出現(xiàn)增殖、自噬、凋亡等細(xì)胞生存功能改變。小凹蛋白1(Caveolin-1)是血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上小凹結(jié)構(gòu)的標(biāo)志性蛋白。研究發(fā)現(xiàn)Caveolin-1對(duì)細(xì)胞增殖、自噬和凋亡起重要調(diào)控作用,但其在缺血性損傷后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用尚不明確。深入了解Caveolin-1在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞功能中的調(diào)控作用,可為缺血性腦損傷的防治提供新的靶點(diǎn)。芹菜素是一種來(lái)源廣泛的植物黃酮,對(duì)腦缺血損傷有神經(jīng)保護(hù)作用,有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞再生作用。其在腦缺血損傷后腦血管保護(hù)和血管再生中的作用及機(jī)制亟待進(jìn)一步探索。本研究目的是以Caveolin-1為切入點(diǎn),探討芹菜素對(duì)腦缺血性損傷后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、血管再生的調(diào)控作用及相關(guān)分子機(jī)制,為芹菜素在缺血性腦損傷中的保護(hù)作用提供理論基礎(chǔ)。方法:采用大鼠大腦中動(dòng)脈線栓法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)復(fù)制局灶性腦缺血損傷模型。芹菜素或Caveolin-1抑制劑daidzin干預(yù)。Zea longa 5分制法進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色觀察腦梗死灶,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor2,VEGFR2)/CD34免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)腦缺血半暗區(qū)新生血管密度,RT-qPCR法檢測(cè)腦缺血半暗區(qū)Caveolin-1 mRNA表達(dá),Western Blot法檢測(cè)腦缺血半暗區(qū)Caveolin-1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)蛋白的表達(dá)。為在細(xì)胞水平進(jìn)一步探討芹菜素介導(dǎo)Caveolin-1保護(hù)缺血性損傷后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、促血管再生作用及機(jī)制,采用人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human brain microvascular endothelial cells,HBMECs)氧糖剝奪復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型,Caveolin-1 基因干擾慢病毒轉(zhuǎn)染抑制Caveolin-1表達(dá),芹菜素干預(yù)細(xì)胞培養(yǎng)。CCK-8法檢測(cè)HBMECs活力,Transwell法檢測(cè)HBMECs遷移,Branch points法觀察HBMECs體外管腔形成,電鏡觀察自噬體形成,流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。RT-qPCR及Western Blot法分別檢測(cè)Caveolin-1、細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果:體內(nèi)下調(diào)Caveolin-1表達(dá),可抑制血管新生,增大腦梗死體積,加重腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀,伴有VEGF、eNOS蛋白表達(dá)減少。芹菜素增加Caveolin-1、VEGF和eNOS蛋白的表達(dá),促腦血管再生,減小腦梗死體積,改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能。體外HBMECs缺血性損傷后,沉默Caveolin-1,抑制細(xì)胞增殖,伴有VEGF表達(dá)減少;加重細(xì)胞自噬,伴有自噬相關(guān)基因Beclin-1表達(dá)上調(diào)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)表達(dá)下調(diào)及微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain3,LC3)Ⅱ/LC3I比值增大;同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡,伴有B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表達(dá)減少。芹菜素能上調(diào)Caveolin-1、VEGF、mTOR、Bcl-2蛋白表達(dá),下調(diào)Beclin-1蛋白表達(dá),減小蛋白LC3II/LC3I比值,促進(jìn)缺血性損傷后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制其自噬和凋亡;Caveolin-1基因沉默能減弱芹菜素所帶來(lái)的上述效應(yīng)。結(jié)論:1.芹菜素增加大鼠腦缺血損傷后腦缺血半暗區(qū)Caveolin-1表達(dá),促進(jìn)腦血管再生,明顯改善大鼠腦神經(jīng)功能。2.芹菜素通過(guò)上調(diào)Caveolin-1表達(dá)促進(jìn)缺血性損傷后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制其自噬和凋亡,保護(hù)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R743.3
【部分圖文】：

?第一部分芹菜素促大鼠缺血性腦損傷后血管再生及相關(guān)機(jī)制???有其形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，即局灶性腦缺血損傷所導(dǎo)致缺血部位大量的神經(jīng)細(xì)胞死亡，??引起神經(jīng)功能障礙，推測(cè)存在其它再生的神經(jīng)細(xì)胞代替己壞死的神經(jīng)細(xì)胞功能??，有利于神經(jīng)功能的康復(fù)。??３?－Ｉ??

?１＼１７？議?ｌ＼ｌ?１?－？？ｌ??圖１－５大鼠腦缺血后腦梗死體積（％）變化（ｎ＝５）??Ｆｉｇｕｒｅｌ－５?Ｔｈｅ?ｃｈａｎｇｅｓ?ｏｆ?ｉｎｆａｒｃｔ?ｖｏｌｕｍｅ?（?％?）?ｉｎ?ｃｅｒｅｂｒａｌ?ｉｓｃｈｅｍｉｃ?ｒａｔｓ?（ｎ＝５）??注：與Ｓ組比較，▲▲Ｐ＜０．０１。??ＩＨ?ｒ？？Ｊ＝７ｄ?／？?＊：?＝?＜ｉ?Ｃａｖｅｏ丨ｉｎ－１?抑：Ｍ劑?＊?ｈ??３５．００?ｆＨ?２４．００?ＣａｖｅｏＩｉｎ－１?／ｒ?裒表??＾?ｋ?抑糾洲?３２．５０?Ａ??？?３０?００?ｚ?Ｊｉ?２?２２?００?’?—｝；?Ｓ?３〇．〇〇?．Ｖ??ｇ?２５．００?｜?２〇?〇〇?；？：?Ｓ?２７．５０??＾?２０．００?＊?１８．００?＾?２５．００?＇?＊??１５．００?１６．００?＊＿?一?２２．５０??Ａ：?１ｉ?７ｄ?１４ｄ?７ｄ?１４ｄ??Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１?抑：Ｍ?削?時(shí)?Ｎ?ｉｉ－｜?ｆｉｉ）??ｉＨｆｕＪ?■?１４ｄ?／；?＊?＾?Ｃａｖｅｏ丨ｉｎ－１?抑糾擁＝Ａ??汀?＊：表?３５．００?Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１?２７?５０?％?４??＾?２４．００?：?Ａ?＾?？?抑糾?＞？?＾?Ａ??Ｓ?Ｓ?３０．００?ｋ．?Ｊ?２５．００?“??＊?２２．００?ｍ?ｋ．?Ｚ?？?ｋ??ｇ?？ｆ，?？?２５．００?？＜?Ｉ?２２?５０?？＜，??ｍ?２０?００?？?４，?＾?２０．００??涯

見(jiàn)不同程度的組織細(xì)胞損傷，神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊、胞體腫脹、胞漿水腫，出現(xiàn)??不同程度的細(xì)胞皺縮及核深染；間質(zhì)水腫，組織間隙增寬；證實(shí)模型制作是成??功的（見(jiàn)圖１－７）。??ｓ??ＩＶＩＶｄ??￣￣＇??ＸｌＶＩＴｃｉ?ＩｌＶｆ：１４ｄ??Ｊ．?°?＾??ＡｌＶＩ７ｃｉ?Ａｌｖｆ?１??－?＊＊?，一．?＾?－?＊＊＊．．??■氣＊??ＸＡＴｖｆＶｄ??、＇?－．＾?＾??＊?－Ｔ?＿?？?．??圖１－７腦缺血半暗區(qū)ＨＥ染色（Ｘ４００）??Ｆｉｇｕｒｅｌ－７?ＨＥ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｏｆ?ｃｅｒｅｂｒａｌ?ｉｓｃｈｅｍｉｃ?ｐｅｎｕｍｂｒａ?（＾４００）??注：紅色箭頭所示為神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹、胞核皺縮。??本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，ＴＴＣ染色出??現(xiàn)不同程度腦梗死灶，腦組織細(xì)胞出現(xiàn)病理改變，說(shuō)明成功制備腦缺血再灌注??損傷模型。Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１抑制劑干預(yù)增大腦梗死體積，加重神經(jīng)功能缺損癥狀，提??示Ｃａｖｅｏｌｉｎ－１參與腦缺血后的病理病程。而芹菜素可以減小腦梗死體積、改善神??經(jīng)功能缺損癥狀，說(shuō)明芹菜素對(duì)缺血性腦損傷有一定的保護(hù)作用。??三、芹菜素對(duì)大鼠腦缺血半暗區(qū)新生血管密度的影響??下一步我們研究芹菜素改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀是否與促進(jìn)血管??再生相關(guān)，我們檢測(cè)了腦缺血半暗區(qū)新生血管密度。新生微血管的形成是腦梗??２８??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2873087