研究背景腦卒中作為世界范圍內(nèi)人類第二大死因,其具體機(jī)制以及治療措施一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。缺血-再灌注損傷時(shí)腦卒中造成腦損傷的主要機(jī)制,涉及到能量缺乏、氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞興奮性中毒、炎癥效應(yīng)等復(fù)雜機(jī)制。由于能量供應(yīng)障礙和氧化應(yīng)激損傷被認(rèn)為是腦缺血-再灌注損傷的關(guān)鍵機(jī)制,因此引起了人們的關(guān)注。UCP2(mitochondrial uncoupling protein 2,線粒體解偶聯(lián)蛋白2)是解偶聯(lián)蛋白家族成員之一,主要功能是作為質(zhì)子通道蛋白促進(jìn)質(zhì)子進(jìn)入線粒體,降低膜電勢(shì),調(diào)控ATP的生成。UCP2在腦等組織中高表達(dá),且在多種應(yīng)激條件下活化,其活性增強(qiáng)可使線粒體內(nèi)NAD~+(nicotinamide adenine dinucleotide,氧化型輔酶I)水平增高。NAD~+是細(xì)胞產(chǎn)能反應(yīng)中重要的輔酶之一,參與了細(xì)胞內(nèi)的糖酵解、氧化磷酸化等過程。因此,NAD~+水平與ATP生成密切相關(guān)NAD~+的水平調(diào)控著Sirtuins家族蛋白的活性。Srituins家族是第三類去乙�；�,其活化依賴于細(xì)胞內(nèi)NAD~+水平,Srituins家族參與調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激、能量產(chǎn)生、細(xì)胞生存/死亡等多個(gè)進(jìn)程。SIRT3(NAD-dependent deacetylase sirtuin-3,線粒體去乙酰化酶3)是定位于線粒體的Sirtuins家族蛋白之一,參與了線粒體能量代謝和氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)。因此,UCP2-SIRT3途徑調(diào)控的能量代謝、氧化應(yīng)激可能是神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。目前認(rèn)為,在細(xì)胞損傷過程中,最初的能量代謝、氧化應(yīng)激等變化趨勢(shì)與細(xì)胞損傷程度不一定呈現(xiàn)線性變化。在損傷過程的早中期,這些變化會(huì)作出代償性反應(yīng),而這種增強(qiáng)的代償性反應(yīng)往往會(huì)在遠(yuǎn)期促進(jìn)細(xì)胞功能障礙,并損傷細(xì)胞,整個(gè)細(xì)胞中這些變化呈現(xiàn)出現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì),因此,需要我們繼續(xù)探討能量代謝、氧化應(yīng)激導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制。研究目的:本實(shí)驗(yàn)利用線栓法建立c57小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型,采用HE染色、TTC染色、WesternBlot等方法,檢測(cè)腦組織在腦缺血-再灌注損傷中能量水平變化、氧化還原狀態(tài)的變化,并使用UCP2特異性抑制劑京尼平,探討UCP2-SIRT3途徑在腦缺血-再灌注損傷中的作用。方法:1.于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司購(gòu)買體重6周齡的c57BL/6雄性小鼠,采取隨機(jī)方式分為5組:(1)假手術(shù)組(sham-operation);(2)缺血1h再灌注24h組(ischemia-1h);(3)缺血2h再灌注24h組(ischemia-2h);(4)京尼平處理假手術(shù)組(g-sham-operation);(5)京尼平處理缺血1h灌注24h組(g-ischemia-1h)。線栓法建立c57小鼠MCAO模型,再灌注24h后,對(duì)各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,TTC和HE染色法觀察各組小鼠大腦梗死面積,及梗死半?yún)^(qū)腦組織形態(tài)學(xué)變化。2.化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)腦組織中NAD~+/NADH、ATP、GSH,SOD活性和SIRT3活性的變化。3.Western Bolt法檢測(cè)腦組織中UCP2、SIRT3、cleaved-caspase3水平的變化。結(jié)果:1.神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、TTC染色及HE染色結(jié)果顯示,缺血-再灌注后,小鼠的腦損傷隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)而加重,腦梗死面積隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)明顯擴(kuò)大;給予京尼平處理后,g-ischemia-1h組腦損傷明顯改善,腦梗死面積減少。2.腦組織ATP檢測(cè)結(jié)果顯示,缺血-再灌注后,小鼠腦組織的ATP含量隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)而明顯降低;給予京尼平處理后,g-ischemia-1h組腦組織ATP含量與g-sham-operation相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明京尼平能有效維持缺血-再灌注損傷小鼠腦組織ATP含量。3.GSH水平與SOD活力檢測(cè)結(jié)果顯示,缺血-再灌注后,小鼠腦組織中GSH含量與SOD活力隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)而明顯降低;給予京尼平處理后,g-ischemia-1h組腦組織GSH含量與SOD活力與g-sham-operation組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異或有所增高,表明京尼平能有效降低缺血-再灌注損傷小鼠腦組織氧化應(yīng)激水平。4.NAD~+/NADH和SIRT3活性檢測(cè)結(jié)果顯示,與sham-operation組相比,ischemia-1h組小鼠腦組織中NAD~+/NADH和SIRT3活性增高;給予京尼平處理后,g-ischemia-1h組腦組織NAD~+/NADH比值和SIRT3活性降低;5.Western Bolt結(jié)果顯示,與sham-operation組相比,ischemia-1h組小鼠腦組織中UCP2和cleaved-caspase3蛋白表達(dá)明顯增高,但SIRT3蛋白表達(dá)無明顯變化;給予京尼平處理后,g-ischemia-1h組腦組織UCP2蛋白表達(dá)降低,cleaved-caspase3和SIRT3蛋白表達(dá)無明顯變化。結(jié)論:1.腦缺血1/2小時(shí)-再灌注后,ATP濃度降低,GSH水平、SOD活力下降。腦缺血1h再灌注后,UCP2表達(dá)與SIRT3活性增強(qiáng),NAD~+/NADH水平增高,腦缺血2h再灌注后,UCP2表達(dá)與SIRT3活性下降,NAD~+/NADH水平下降。提示UCP2、SIRT3早期發(fā)揮代償,晚期發(fā)揮損傷作用,表明UCP2、SIRT3、介導(dǎo)氧化應(yīng)激/能量代謝紊亂與腦缺血-再灌注組織損傷有關(guān);2.京尼平能夠抑制腦缺血1小時(shí)-再灌注UCP2表達(dá),可以維持ATP水平,降低NAD~+/NADH水平和SIRT3活性,增強(qiáng)能量代謝,抑制氧化應(yīng)激,進(jìn)而減輕腦組織損傷程度,這進(jìn)一步支持了UCP2、SIRT3、介導(dǎo)氧化應(yīng)激/能量代謝紊亂與腦缺血-再灌注組織損傷有關(guān)。綜上,我們推測(cè)UCP2-SIRT3信號(hào)通路通過能量代謝/氧化應(yīng)激調(diào)控腦缺血-再灌注細(xì)胞損傷。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R743
【部分圖文】：

頸內(nèi)動(dòng)脈方向小心插入鈍頭線栓處，維持缺血 1h 后，拔出線栓，0mg/支，化學(xué)式為 C11H14O5，相抑制劑。結(jié)構(gòu)見圖 2.1。使用時(shí)配g 體重的比例對(duì) c57 小鼠每天進(jìn)

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果同缺血時(shí)間對(duì)小鼠腦缺血-再灌注損傷的影響同缺血時(shí)間對(duì)小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響 Longa 等規(guī)定的的五級(jí)四分法，在對(duì)照組中每組隨機(jī)選取 10 只分。結(jié)果顯示：與 ischemia-1h 組相比，ischemia-2h 組模型的神高，這表明腦組織的損傷水平隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)而加重（圖 3

3.2 不同缺血時(shí)間對(duì) c57 小鼠腦梗死面積的影（means±SD,n = 5,*P<0.05）時(shí)間對(duì)小鼠海馬 CA1 區(qū)損傷的影響察腦組織 CA1 區(qū)（圖 3.3，放大倍數(shù) 400 倍鼠海馬 CA1 區(qū)細(xì)胞排列混亂，細(xì)胞核固縮，并出現(xiàn)細(xì)胞損傷表現(xiàn)進(jìn)一步加重。
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