研究目的:1、建立可靠的缺血預(yù)處理(IPC)大鼠模型,用于后續(xù)探討IPC誘導(dǎo)缺血耐受的相關(guān)機(jī)制;2、分別觀察IPC后大鼠腦組織和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中PPARγ及其靶基因LPL、CD36、CAT、Bcl-2等隨時(shí)間的表達(dá)變化,以及皮層中PPARγ的細(xì)胞定位,初步探討這些變化的影響和意義;3、觀察腦缺血后不同再灌注時(shí)間點(diǎn)(1d、3d、7d、12d)IPC大鼠腦組織和PBMCs中PPARγ、NFκB的表達(dá)及活性改變,及炎癥指標(biāo)COX-2、3NT等的表達(dá)變化,評(píng)估IPC對(duì)后續(xù)腦缺血再灌注損傷的影響,并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討。實(shí)驗(yàn)方法:1、選取夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈(BCCAO)的方法建立大鼠IPC模型,通過行為學(xué)評(píng)分、TTC染色、腦組織冰凍切片的Hoechst染色、免疫熒光法檢測(cè)HSP70表達(dá)來評(píng)估該IPC模型的可靠性。2、將SD大鼠隨機(jī)分為IPC模型組(IPC組)、假手術(shù)組(Sham組),根據(jù)術(shù)后1d、3d、7d、12d四個(gè)時(shí)間點(diǎn),將各組隨機(jī)分為4個(gè)亞組:(1)采用Western blot法檢測(cè)各組皮層組織和PBMCs中PPARγ及其靶基因LPL、CD36、CAT、Bcl-2總蛋白的表達(dá),以觀察PPARγ表達(dá)及活性隨時(shí)間的變化;(2)采用免疫熒光法觀察腦組織中PPARγ、LPL的細(xì)胞定位。3、將SD大鼠隨機(jī)分為IPC后腦缺血再灌注損傷組(IPC-I/R組)、單純腦缺血再灌注損傷組(I/R組)、正常對(duì)照組(Contrl組)三組,根據(jù)不同再灌注時(shí)間1d、3d、7d、12d,將IPC-I/R組、I/R組隨機(jī)分為4個(gè)亞組:(1)采用行為學(xué)評(píng)分及TTC染色對(duì)IPC-I/R-3d亞組與I/R-3d亞組的腦組織損傷進(jìn)行評(píng)價(jià),觀察IPC是否對(duì)后續(xù)I/R產(chǎn)生保護(hù)作用;(2)采用Western blot法檢測(cè)各組腦組織PPARγ總蛋白表達(dá),免疫熒光法檢測(cè)皮層神經(jīng)元中PPARγ的亞細(xì)胞定位,觀察并比較IPC-I/R組和I/R組PPARγ表達(dá)及核移位(代表其活性)隨再灌注時(shí)間的變化;(3)采用Western blot法檢測(cè)各組皮層NF-κB、COX-2的總蛋白表達(dá),免疫熒光法檢測(cè)腦組織神經(jīng)元中NF-κB的亞細(xì)胞定位及3-NT的表達(dá),觀察IPC是否可減輕后續(xù)I/R腦組織的炎癥反應(yīng);(4)采用Western blot法檢測(cè)各組PBMCs中PPARγ及其靶基因CD36的總蛋白表達(dá),觀察并比較IPC-I/R組和I/R組PBMCs中PPARγ表達(dá)及活性隨再灌注時(shí)間的變化;(5)采用Western blot法檢測(cè)各組PBMCs中NF-κB總蛋白的表達(dá),觀察IPC是否可減輕后續(xù)I/R外周的炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、模型評(píng)價(jià):對(duì)BCCAO法制作的IPC大鼠模型進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分未見神經(jīng)功能缺損,TTC染色無梗死灶,Hoechst染色未見細(xì)胞凋亡,HSP70表達(dá)明顯增加(P0.001,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),表明該方法制作的IPC模型穩(wěn)定、可靠。2、IPC大鼠腦組織、PBMCs中PPARγ的表達(dá)變化:(1)Western blot檢測(cè):與Sham組相比,IPC大鼠腦組織和PBMCs中PPARγ總蛋白表達(dá)增加(均P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),且兩者隨時(shí)間的表達(dá)變化一致,均表現(xiàn)為先增高后下降的趨勢(shì),于IPC后第3天到達(dá)高峰(與IPC-1d、IPC-7d、IPC-12d組相比,IPC-3d組明顯增加,均P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),隨后下降;PPARγ靶基因LPL、CAT、Bcl-2、CD36的表達(dá)變化與PPARγ一致,均于IPC后第3天到達(dá)高峰,隨后下降;(2)免疫熒光檢測(cè):IPC大鼠腦組織中PPARγ的表達(dá)主要位于神經(jīng)元,小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中均未見明顯表達(dá);與Sham組相比,IPC大鼠腦組織神經(jīng)元中PPARγ靶基因LPL表達(dá)明顯增加(P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。3、IPC對(duì)后續(xù)I/R的影響及相關(guān)機(jī)制探討:(1)腦損傷評(píng)價(jià):與同一再灌注時(shí)間點(diǎn)的I/R亞組相比,IPC-I/R各亞組的神經(jīng)功能缺損減輕(均P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義);與I/R-3d亞組相比,IPC-I/R-3d亞組腦梗死體積明顯縮小(P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。(2)Western blot檢測(cè):1)腦組織PPARγ的表達(dá):IPC-I/R組、I/R組PPARγ的表達(dá)均隨再灌注時(shí)間呈先增高后下降趨勢(shì),均于再灌注3d達(dá)到高峰,隨后下降;與同一再灌注時(shí)間點(diǎn)的I/R組相比,IPC-I/R組PPARγ的表達(dá)再灌注1d增高(P0.05),再灌注3d減低(P0.05),再灌注7d、12d略有增高(均P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即與I/R組相比,IPC-I/R組PPARγ表達(dá)基礎(chǔ)值較高,峰值略低,但持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng);2)腦組織NF-κB的表達(dá):IPC-I/R組NF-κB表達(dá)在再灌注1d最高,隨后逐漸下降,再灌注7d、12d恢復(fù)至正常水平;I/R組NF-κB表達(dá)呈先增高后下降趨勢(shì),于再灌注3d達(dá)到高峰;在同一再灌注時(shí)間點(diǎn),IPC-I/R組NF-κB的表達(dá)低于I/R組(均P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3)腦組織COX-2的表達(dá):IPC-I/R組與I/R組的表達(dá)均呈先增高后下降趨勢(shì),均于再灌注3d到達(dá)高峰,隨后下降;在同一再灌注時(shí)間點(diǎn),IPC-I/R組COX-2的表達(dá)低于I/R組(均P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示IPC可減輕后續(xù)I/R誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng);4)PBMCs中PPARγ表達(dá):IPC-I/R組與I/R組的表達(dá)均呈先增高后下降趨勢(shì),均于再灌注3d到達(dá)高峰,隨后下降;與相同再灌注時(shí)間點(diǎn)的I/R組相比,IPC-I/R-1d亞組PPARγ表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),IPC-I/R-3d亞組PPARγ表達(dá)減少(P0.05),IPC-I/R-7d、IPC-I/R-12d亞組表達(dá)增加(均P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5)PBMCs中CD36表達(dá):IPC-I/R組與I/R組的表達(dá)均呈先增高后下降趨勢(shì),均于再灌注3d到達(dá)高峰,隨后下降;與相同再灌注時(shí)間點(diǎn)的I/R組相比,IPC-I/R組CD36的表達(dá)均增加(均P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示IPC-I/R組PPARγ活性強(qiáng)于I/R組。6)PBMCs中NF-κB表達(dá):IPC-I/R組NF-κB表達(dá)隨再灌注時(shí)間無明顯變化趨勢(shì),I/R組NF-κB表達(dá)呈先增高后下降趨勢(shì),在再灌注3d到達(dá)高峰;在同一再灌注時(shí)間點(diǎn),IPC-I/R組NF-κB的表達(dá)低于I/R組(均P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示IPC-I/R組的外周炎癥反應(yīng)弱于I/R組。(2)免疫熒光檢測(cè):1)腦組織PPARγ:IPC-I/R組PPARγ表達(dá)多位于神經(jīng)元胞核內(nèi),I/R組PPARγ表達(dá)多位于神經(jīng)元胞漿內(nèi);2)腦組織NF-κB:IPC-I/R組NF-κB表達(dá)多位于神經(jīng)元胞漿內(nèi),I/R組NF-κB表達(dá)多位于神經(jīng)元胞核內(nèi);3)腦組織3-NT:在同一再灌注時(shí)間點(diǎn),IPC-I/R組3-NT表達(dá)少于I/R組(均P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn) 結(jié)論:1、IPC后腦組織和PBMCs中PPARγ的表達(dá)和活性增加,且腦組織的PPARγ主要分布于神經(jīng)元。IPC可能通過上調(diào)皮層神經(jīng)元中PPARγ的表達(dá)和活性,提高其抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡的耐受能力,產(chǎn)生直接的神經(jīng)保護(hù)作用;IPC也可能通過調(diào)節(jié)外周免疫細(xì)胞,產(chǎn)生系統(tǒng)性的保護(hù)作用,間接保護(hù)神經(jīng)元。2、IPC后腦組織與PBMCs中PPARγ的表達(dá)和活性隨時(shí)間的變化具有一致性,PPARγ或可作為評(píng)估是否具有IPC保護(hù)作用的生物標(biāo)志物。3、IPC可同時(shí)減輕中樞和外周炎癥反應(yīng),對(duì)后續(xù)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與IPC上調(diào)腦組織和PBMCs中PPARγ的表達(dá)和活性,提高抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡的能力有關(guān)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R743.3
【部分圖文】：

圖 1.1 腦組織 TTC 染色1.2.3 細(xì)胞凋亡的觀察Hoechst 染色結(jié)果顯示（圖 1.2），Sh均一，呈深藍(lán)色，細(xì)胞核無波紋狀或裂細(xì)胞凋亡。而作為陽(yáng)性對(duì)照的腦缺血再核固縮，致密濃染，呈亮藍(lán)色，可見細(xì)

圖 1.1 腦組織 TTC 染色1.2.3 細(xì)胞凋亡的觀察Hoechst 染色結(jié)果顯示（圖 1.2），Sham 組與 IPC 組腦組織神經(jīng)元細(xì)胞核染色均一，呈深藍(lán)色，細(xì)胞核無波紋狀或裂縫樣改變，無染色質(zhì)濃縮，即未見明顯細(xì)胞凋亡。而作為陽(yáng)性對(duì)照的腦缺血再灌注損傷組（I/R 組）腦組織神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，致密濃染，呈亮藍(lán)色，可見細(xì)胞核碎裂，存在明顯的細(xì)胞凋亡。

圖 1.3 IPC 后腦組織 HSP70 的表達(dá)變化1.2.5 IPC 后腦組織 PPARγ的表達(dá)變化（1）腦組織 PPARγ 總蛋白 Western blot 檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果顯示，隨手術(shù)時(shí)間（1d、3d、7d、12d）的推移，Sham 組 PP蛋白表達(dá)無明顯改變，IPC 組 PPARγ 總蛋白表達(dá)呈先增高后下降趨勢(shì)，3d 達(dá)到高峰（與 IPC-1d、IPC-7d、IPC-12d 組相比，IPC-3d 組明顯增加，均 P差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），隨后下降。與 Sham 組相比，在同一術(shù)后時(shí)間點(diǎn)組 PPARγ 總蛋白表達(dá)均增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.237，t=45.56，t=t=6.807，均 P<0.05）（圖 1.4）。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2864183