背景顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(IA)通常是一種遲發(fā)性疾病,影響1-3%的普通人群,并導(dǎo)致危及生命的蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)。遺傳易感性與IAs有關(guān),但致病基因仍不明確。方法和結(jié)果作者對(duì)11個(gè)家系的20例中國漢族IA患者進(jìn)行了新一代測序(NGS)。利用生物信息學(xué)篩選技術(shù)尋找罕見和低頻等位基因頻率的候選有害變異。作者也進(jìn)一步研究了多個(gè)種族樣本中的候選變異,這些樣本包括86個(gè)全外顯子組測序,測序數(shù)據(jù)均來自于先前發(fā)表的三項(xiàng)研究中的家族性IA病例。在中國發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中,低頻變異c.4394CA_p.Ala1465Asp(rs2298808)ARHGEF17明顯與IA相關(guān)(P=7×10~(-4),OR=7.34),隨后在日本家族性IA患者中進(jìn)行了重復(fù)性研究(P=0.04,OR=4.00,95%CI=0.832-14.8)。在中國1031例散發(fā)性IA患者和599例對(duì)照個(gè)體中,上述發(fā)現(xiàn)也得到了證實(shí)(P=0.023,OR=1.55,95%CI=1.00-2.46)。結(jié)合來自4個(gè)不同種族(即中國人、日本人、歐洲裔美國人和法裔加拿大人)的所有家族性IA患者的測序數(shù)據(jù),病例與對(duì)照組比較,發(fā)現(xiàn)ARHGEF17的突變負(fù)荷顯著增加(21/106 vs 11/306,P=8.1×10~(-7),OR=6.6,95%CI=2.9-15.8)。在arhgef17敲降斑馬魚中,ARHGEF17在腦血管中高度表達(dá)。arhgef17基因敲除導(dǎo)致斑馬魚腦區(qū)血液外溢。內(nèi)皮病變僅在arhgef17缺陷斑馬魚的腦血管上發(fā)現(xiàn)。作者通過慢病毒shRNA敲降HUVEC中ARHGEF17,通過RNA-seq技術(shù),發(fā)現(xiàn)了190個(gè)上調(diào),141個(gè)下調(diào)的差異基因,并且我們對(duì)這些差異基因進(jìn)行了GO富集分析和KEEG富集分析,發(fā)現(xiàn)部分差異基因富集到了和IA相關(guān)的炎性和細(xì)胞間連接的通路。結(jié)論ARHGEF17是IA的危險(xiǎn)基因。ARHGEF17突變可能破壞了顱內(nèi)血管的炎性水平和細(xì)胞間連接進(jìn)而損傷腦血管而促使IA發(fā)生和發(fā)展。當(dāng)然這一假設(shè)未來還需要通過IA小鼠模型和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R743
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語/符號(hào)說明
前言
    研究現(xiàn)狀、成果
    研究目的、方法
一、高通量測序技術(shù)探尋顱內(nèi)動(dòng)脈瘤候選基因的研究
    1.1 對(duì)象和方法
        1.1.1 我們確定的家族性IA病例和散發(fā)性病例
        1.1.2 在既往未完全研究的家族性IA病例進(jìn)行重復(fù)研究和驗(yàn)證
        1.1.3 發(fā)現(xiàn)研究階段和重復(fù)研究階段的對(duì)照組人群
        1.1.4 散發(fā)性IA病例中重復(fù)研究發(fā)現(xiàn)低頻危險(xiǎn)變異位點(diǎn)
        1.1.5 醫(yī)學(xué)倫理學(xué)聲明
        1.1.6 基因組測序和質(zhì)量控制
        1.1.7 推斷樣本的種族
        1.1.8 IA候選變異的優(yōu)先級(jí)
        1.1.9 基因水平的變異富集檢驗(yàn)（Gene-level variant enrichment test）
        1.1.10 Identity-by-Descent（IBD）分析
        1.1.11 RNA表達(dá)分析
        1.1.12 蛋白建模
        1.1.13 WGS建庫測序流程
        1.1.14 WES建庫測序流程
    1.2 結(jié)果
        1.2.1 通過基因組測序確定了30 個(gè)候選基因變異位點(diǎn)
        1.2.2 在其他家族性動(dòng)脈瘤病例中重復(fù)性研究所篩選候選變異
        1.2.3 基因水平變異富集分析發(fā)現(xiàn)IA病例ARHGEF17 的變異負(fù)荷明顯高于對(duì)照組
        1.2.4 ARHGEF17 變異的系譜和IBD分析
        1.2.5 散發(fā)性IA的相關(guān)性分析又提供了證據(jù)支持ARHGEF17是IA的危險(xiǎn)基因
        1.2.6 ARHGEF17 功能及其突變的功能研究
    1.3 討論
    1.4 小結(jié)
二、斑馬魚模型驗(yàn)證IA候選基因ARHGEF17
    2.1 對(duì)象和方法
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)器材和試劑
            主要實(shí)驗(yàn)儀器
            主要試劑
        2.1.2 斑馬魚的飼養(yǎng)條件
            2.1.2.1 斑馬魚的生存條件
            2.1.2.2 斑馬魚的飼養(yǎng)和繁殖
            2.1.2.3 斑馬魚的體外受精技術(shù)
            2.1.2.4 斑馬魚的安樂死
        2.1.3 斑馬魚品系
        2.1.4 斑馬魚胚胎原位雜交
        2.1.5 免疫熒光觀察斑馬魚腦血管的ARHGEF17 的表達(dá)
            2.1.5.1 固定和包埋
            2.1.5.2 脫蠟
            2.1.5.3 抗原修復(fù)
            2.1.5.4 染色
        2.1.6 Morpholinos敲降斑馬魚ARHGEF
        2.1.7 mRNA挽救實(shí)驗(yàn)
        2.1.8 共聚焦成像分析
    2.2 結(jié)果
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
三、通過RNA-Seq初探ARHGEF17 功能缺失與IA關(guān)系
    3.1 對(duì)象和方法
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)器材和試劑
        3.1.2 HUVEC 的原代培養(yǎng)
        3.1.3 構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒
            3.1.3.1 克隆構(gòu)建部分
            3.1.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與慢病毒收獲
            3.1.3.3 慢病毒濃縮與純化
            3.1.3.4 慢病毒質(zhì)量檢測
        3.1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染HUVEC
        3.1.5 測序
            3.1.5.1 建庫測序流程（圖26）
            3.1.5.2 生物信息學(xué)分析流程（圖27）
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異表達(dá)基因
        3.2.2 GO 富集分析
        3.2.3 差異基因KEGG富集分析
    3.3 討論
        3.3.1 IA和炎癥之間的關(guān)系
        3.3.2 IA和細(xì)胞間連接的關(guān)系
    3.4 小結(jié)
全文結(jié)論
論文創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文和參加科研情況說明
綜述 顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展簡述
    1.顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)的遺傳疾病
    2.家族性顱內(nèi)動(dòng)脈瘤
    3.散發(fā)性顱內(nèi)動(dòng)脈瘤
    4.顱內(nèi)動(dòng)脈瘤轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
    5.顱內(nèi)動(dòng)脈瘤表觀遺傳學(xué)研究
    6.與 IA相關(guān)的血管生成因子
    7.IA和炎癥之間的關(guān)系
    8.IA和細(xì)胞間連接的關(guān)系
    9.展望
    綜述參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡歷

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