目的:研究報道CSN(COP9 signalosome)信號小體家族中的CSN6在膠質(zhì)母細胞瘤中過表達與腫瘤進展密切相關(guān),同時有臨床數(shù)據(jù)證明抑制PD-1/PD-L1免疫治療策略可能為膠質(zhì)母細胞瘤的治療提供新的思路。CSN信號小體可能與腫瘤相關(guān)蛋白的泛素化調(diào)節(jié)相關(guān),有研究證實CSN家族成員可以使PD-L1蛋白穩(wěn)定性增加引起乳腺癌的免疫逃逸。但是CSN6是否通過影響PD-L1蛋白的穩(wěn)定性,進而調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤中PD-L1表達還不清楚。因此,本研究采用人膠質(zhì)瘤標本以及體外培養(yǎng)膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤細胞,探討EGFR-ERK通路是否通過調(diào)控CSN6表達,進而介導(dǎo)膠質(zhì)母細胞瘤中PD-L1蛋白的表達,旨在為膠質(zhì)母細胞瘤的相關(guān)免疫靶向治療提供新的思路與研究方向。方法:1.收集人膠質(zhì)瘤標本,采用免疫組織化學法和免疫熒光檢測EGFR、CSN6和PD-L1共表達情況;分析其與臨床病理學特征和預(yù)后的相關(guān)性。2.培養(yǎng)人膠質(zhì)母細胞瘤細胞U87和U251,體外給予EGF激活細胞EGFR-ERK通路,給予ERK阻斷劑或siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制CSN6表達,在細胞水平驗證激活EGFR-ERK通路調(diào)控CSN6對PD-L1轉(zhuǎn)錄后蛋白表達的影響。結(jié)果:1.不同級別人類膠質(zhì)瘤組織標本中EGFR,CSN6和PD-L1表達與預(yù)后相關(guān)性TCGA庫中人類膠質(zhì)瘤組織標本中mRNA水平上EGFR在膠質(zhì)母細胞瘤中表達水平最高(P0.0001),與病人不良預(yù)后具有相關(guān)性(P0.05)。CSN6在膠質(zhì)母細胞瘤中表達水平高于星形膠質(zhì)瘤,星形膠質(zhì)瘤中的表達水平高于正常腦組織(P0.0001),與病人不良預(yù)后具有相關(guān)性(P0.05)。PD-L1在膠質(zhì)母細胞瘤中表達水平高于星形膠質(zhì)瘤(P0.05),與病人不良預(yù)后具有相關(guān)性(P0.05)。本研究選取的標本分析結(jié)果提示人膠質(zhì)母細胞瘤組織標本中EGFR蛋白表達高于星形膠質(zhì)瘤IHC評分[Astrocytoma:1(0,4)vs glioblastoma:4(2,9)](P0.0001),星形膠質(zhì)瘤病人標本中EGFR蛋白高于正常腦組織,IHC評分[Normal brain:0(0,0)vs astrocytoma:1(0,4)](P=0.0002);膠質(zhì)母細胞瘤與間變星形膠質(zhì)瘤中EGFR蛋白表達沒有統(tǒng)計學差異IHC評分[Anaplastic astrocytoma:6(3,12)vs glioblastoma:4(2,9)](P=0.1344)。EGFR蛋白高表達與病人不良預(yù)后具有正相關(guān)性(P0.0001)。人膠質(zhì)母細胞瘤組織標本中CSN6蛋白的表達高于星形膠質(zhì)瘤,IHC評分[Astrocytoma:0(0,2)vs glioblastoma:4(1,6)](P0.0001),星形膠質(zhì)瘤病人標本中CSN6蛋白與正常腦組織表達沒有統(tǒng)計學差異,IHC評分[Normal brain:0(0,1)vs astrocytoma:0(0,2)](P=0.0969);CSN6蛋白在膠質(zhì)母細胞瘤中表達情況高于間變星形膠質(zhì)瘤,IHC評分[Anaplastic astrocytoma:4(2,8)vs glioblastoma:4(1,6)](P=0.0388)。CSN6蛋白高表達與病人不良預(yù)后具有正相關(guān)性(P0.0001)。人膠質(zhì)母細胞瘤組織標本中PD-L1蛋白表達高于星形膠質(zhì)瘤,IHC評分[Astrocytoma:1(0,2)vs glioblastoma:4(1,9)](P=0.0002),星形膠質(zhì)瘤病人標本中PD-L1蛋白高于正常腦組織,IHC評分[Normal brain:0(0,0.25)vs astrocytoma:1(0,2)](P=0.0036);膠質(zhì)母細胞瘤與間變星形膠質(zhì)瘤中PD-L1蛋白表達沒有統(tǒng)計學差異,IHC評分[Anaplastic astrocytoma:4(2,9)vs glioblastoma:4(1,9)](P=0.2226)。PD-L1蛋白高表達與病人不良預(yù)后具有正相關(guān)性(P=0.0019)。2.人類膠質(zhì)瘤組織標本中EGFR,CSN6和PD-L1表達相關(guān)性免疫熒光結(jié)果顯示:EGFR和CSN6;CSN6和PD-L1蛋白在膠質(zhì)瘤細胞中可以共表達;免疫組織化學結(jié)果分析EGFR、CSN6和PD-L1蛋白在膠質(zhì)瘤組織中表達具有正相關(guān)性。3.膠質(zhì)母細胞瘤PD-L1表達與腫瘤微環(huán)境中CD8~+T細胞浸潤相關(guān)性。PD-L1蛋白表達與腫瘤微環(huán)境中CD8~+T細胞浸潤呈負向相關(guān)性,其中PD-L1~(Low)CD8~+T~(More)的病人預(yù)后最好,PD-L1蛋白表達和CD8~+T浸潤聯(lián)合檢測,對病人預(yù)后判斷具有重要意義。4.EGFR-ERK信號通路調(diào)控CSN6對膠質(zhì)母細胞瘤PD-L1表達的影響。體外給予EGF刺激激活EGFR-ERK通路,上調(diào)CSN6和PD-L1表達;阻斷ERK通路,抑制CSN6和PD-L1表達。通過siRNA技術(shù)敲低CSN6蛋白后,EGFR-ERK通路無法上調(diào)PD-L1蛋白。半衰期實驗發(fā)現(xiàn)抑制EGFR-ERK通路促進新蛋白合成后,EGF仍然能夠維持PD-L1蛋白的表達水平,進而提示激活CSN6延長PD-L1蛋白半衰期,PD-L1蛋白的穩(wěn)定性增加。結(jié)論:1.人類膠質(zhì)瘤組織標本中EGFR、CSN6和PD-L1蛋白表達具有正相關(guān)性,與病人不良預(yù)后密切相關(guān)。PD-L1蛋白表達與腫瘤微環(huán)境中CD8~+T細胞浸潤呈負向相關(guān)性,其中PD-L1~(Low)CD8~+T~(More)的病人預(yù)后最好,PD-L1蛋白表達和CD8~+T浸潤聯(lián)合檢測,對病人預(yù)后判斷具有重要意義。2.體外實驗中,EGFR-ERK信號通路激活可以上調(diào)膠質(zhì)母細胞瘤中CSN6表達,進而調(diào)控PD-L1蛋白表達穩(wěn)定性。
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

25圖2膠質(zhì)瘤中EGFR, CSN6和PD-L1蛋白表達的相關(guān)性Fig.2 Correlation between EGFR, CSN6 and PD-L1 expression in humanglioma tissues.Immunofluorescence staining indicated that EGFR and CSN6 or CSN6and PD-L1 proteins could co-express in glioma tissues (A). Representative

圖 3 PD-L1 在人腦膠質(zhì)母細胞瘤組織樣本中的表達情況及其與 CD8+TILs浸潤密度的關(guān)系和臨床預(yù)后的關(guān)系Fig.3 The correlation between PD-L1 expression and CD8+T cell infiltrationnumber in tumor microenvironment.Representative images of higher level PD-L1 expression and low CD8+Tcell infiltration in different cases of glioblastoma samples are shown (A).Representative images of lower level PD-L1 expression and high CD8+T cellinfiltration in different cases of glioblastoma samples are shown (B). CD8+Tcell infiltration was shown in low and high level PD-L1 GBM samples (C).PD-L1 protein expression was significantly negatively correlated with CD8+Tcell infiltration in tumor microenvironment (D). The combination of PD-L1protein expression and CD8+T infiltration was related with patient survival inhuman GBM (E,F,G).

圖 4 EGFR-ERK 信號通路激活上調(diào) CSN6 和 PD-L1 蛋白的表達Fig.4 CSN6, activated by EGFR-ERK pathway, regulate PD-L1 proteinexpression in vitroKnockdown of CSN6 protein by siRNA inhibited PD-L1 upregulationon the EGFR-ERK pathway. After inhibiting the synthesis of new protein the half-life experiment, EGF still maintained the existence of PD-L1tein, which suggests that CSN6 by EGFR-ERK pathway increase thebility of PD-L1 protein in GBM. U87 (A) and U251 (B) cells were treatedth EGF(200ng/ml) for 2, 4, 6, 8, 10h. U87 (C) and U251 (D) cells wereated with different doses of EGF for 5 h. U87 (E) and U251 (F) cells wereated with or without PD98059 (20 μM) for 1 h and then treated with EGF0 ng/ml) for 5h. The expression of CSN6、EGFR、p-ERK and PD-L1 wasasured by Western blot(*P＜0.05,*vs Contral).
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本文編號：2857820