目的1、建立神經(jīng)病理性疼痛(SNI)大鼠模型,為研究導(dǎo)致其發(fā)生的物理及化學(xué)性因素提供一個良好的基礎(chǔ)。2、研究產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛的相應(yīng)區(qū)域的蛋白質(zhì)在整體水平上發(fā)生的巰基亞硝基化的程度變化。3、正常SD大鼠鞘內(nèi)給與不同濃度的NO供體或前體,觀察大鼠行為學(xué)變化及蛋白亞硝基化水平的變化。4、使用可以逆轉(zhuǎn)已發(fā)生的蛋白質(zhì)巰基亞硝基化的試劑,是否可以顯著減輕神經(jīng)病理性疼痛大鼠的痛覺過敏反應(yīng)。方法1、選用體重300-350g的雄性SD大鼠,制備SNI動物模型,即結(jié)扎后離斷大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)的分支腓總神經(jīng)和脛神經(jīng),保留腓腸神經(jīng),避免牽拉或損傷,對照組即假手術(shù)組,暴露神經(jīng)后保護所有神經(jīng)及分支不受牽拉或損傷,其余同手術(shù)SNI組,觀察大鼠有疼痛行為后,于術(shù)后每天進行應(yīng)用動態(tài)足底觸覺計對各組大鼠的右足機械痛程度進行量化并進行比較,50%縮足反應(yīng)閾值(PWT)=10log(x)+kδ,PWT小于4g作為出現(xiàn)機械痛敏的標準,建模失敗者將排除實驗之外,Western blot檢測全部蛋白質(zhì)的亞硝基化水平。2、選用體重300-350g的雄性SD大鼠鞘內(nèi)置管:即蛛網(wǎng)膜下腔置管。大鼠麻醉后,采用旁側(cè)入路。平行于兩側(cè)髂棘連線中點到尾椎起點的連線,旁開0.5cm,導(dǎo)管頭端進入蛛網(wǎng)膜下腔約2cm,將導(dǎo)管一端固定于筋膜層,另一端引至大鼠后頸部固定在皮膚上,熱凝封閉備用。清醒后選擇無后肢運動異常的大鼠,經(jīng)導(dǎo)管給予局麻藥2%利多卡因10μl,如出現(xiàn)后肢癱瘓證明鞘內(nèi)置管成功,恢復(fù)一周后用于實驗。3、選用體重300-350g的雄性SD大鼠,取36只大鼠制備SNI動物模型,觀察大鼠有疼痛行為后(保留6只正常大鼠),隨機分為6組,每組6只,建立各實驗組:N組(正常組);S組(假手術(shù)組):大鼠右下肢神經(jīng)不做結(jié)扎及切斷;SNI組,又將其按天數(shù)分為D1組;D4組;D7組;D14組。于第1,4,7,14天各組處死6只,取脊髓組織腰膨大處。4、選用體重300-350g的雄性SD大鼠,鞘內(nèi)置管,恢復(fù)7天后用于實驗。取24只大鼠根據(jù)鞘內(nèi)給與不同濃度的NO供體GSNO隨機分為4組,每組6只,建立各實驗組:O對照組(DMSO 10μl)、A組(GSNO 10μg/10μl)、B組(GSNO30μg/10μl),C組(GSNO 90μg/10μl)。上述藥物每日均進行鞘內(nèi)注射。于連續(xù)給藥后第7天,處死各組大鼠,取脊髓組織腰膨大處。5、選用體重300-350g的雄性SD大鼠,鞘內(nèi)置管,恢復(fù)7天后用于實驗。取18只大鼠制備SNI動物模型,觀察大鼠有疼痛行為后,隨機分為3組,每組6只,建立各實驗組。O組(對照組):鞘內(nèi)給與100%DMSO 10μl;NEM組:鞘內(nèi)給與NEM 100μg/10μl,亞硝基化阻斷劑;ODQ組:鞘內(nèi)給與ODQ30μg/10μl,PKG通路阻斷劑。上述藥物每日均進行鞘內(nèi)注射。于連續(xù)給藥后第7天,處死大鼠,取脊髓組織腰膨大處。6、用應(yīng)用動態(tài)足底觸覺計每日對各組大鼠的機械痛程度進行量化并進行比較,Western blot檢測全部蛋白質(zhì)的亞硝基化水平。7、脊髓背角總蛋白的檢測:遮光條件下,取大鼠L4-L6(腰膨大)的脊髓裂解、離心取上清。用生物素轉(zhuǎn)化法使發(fā)生亞硝基化的蛋白質(zhì)生物素化,利用鏈霉親和瓊脂糖(streptavidin-agarose)將生物素化的蛋白質(zhì)從裂解液中提取出來,制備樣本。結(jié)果1、SNI模型SD大鼠術(shù)后術(shù)側(cè)足輕度外翻并有自發(fā)性疼痛和痛覺過敏的表現(xiàn),SNI模型SD大鼠于術(shù)后第4天開始產(chǎn)生明顯的疼痛,術(shù)側(cè)足的50%縮足閾值明顯下降,P0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義,由此明確神經(jīng)病理性疼痛模型建模成功。手術(shù)后第7天50%縮足閾值下降到峰值,持續(xù)至術(shù)后28天。2、SD大鼠鞘內(nèi)給與不同濃度的NO供體GSNO,各組大鼠50%縮足閾值在GSNO 30μg/10μl濃度時開始增高,整體水平上的蛋白質(zhì)亞硝基化水平降低趨勢明顯,有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。3、SNI模型SD大鼠鞘內(nèi)置管分別給與有DMSO、阻斷劑NEM和ODQ,各組大鼠機械痛閾值和全部蛋白質(zhì)發(fā)生亞硝基化的水平比較:使用阻斷劑NEM的大鼠機械疼痛值明顯增高,全蛋白發(fā)生亞硝基化明顯降低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001);使用阻斷劑ODQ的PKG通路蛋白含量亦有降低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1、整體水平上的蛋白質(zhì)發(fā)生亞硝基化的程度與神經(jīng)病理性疼痛的具有正相關(guān)性。2、從一定濃度開始,NO即可以使蛋白質(zhì)發(fā)生亞硝基化。3、亞硝基化阻斷劑NEM及PKG通路阻斷劑ODQ對神經(jīng)病理性疼痛均有治療作用,NEM作用比較明顯。
【學(xué)位單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R741
【部分圖文】：

162、整體水平蛋白質(zhì)巰基亞硝基化的提純與檢測：圖1 蛋白質(zhì)巰基發(fā)生亞硝基化的提純過程（1）每個樣品取出 15μl，加 HENS Buffer 稀釋到 60μl，各加 2μl MMTS 均勻混合 1min，避光室溫下孵育 30min，封閉游離的半胱氨酸硫醇。（2）在-20℃下，加入 600μl 的預(yù)冷丙酮進行沉淀，去除 MMTS，沉淀至少1 小時。（3）4℃離心機進行樣品離心 1000g×10min

結(jié) 果、SD 大鼠 SNI 模型術(shù)后情況術(shù)后大鼠傷口無感染，多數(shù)逐漸愈合，少數(shù)大鼠術(shù)后 2 天開始出現(xiàn)由于疼咬傷口，開線化膿等情況，則重新消毒，進行縫合；鞘內(nèi)置管的 SD 大鼠有出現(xiàn)脫管，穿刺部位水腫，偏癱，自噬等情況，為建模不成立。其他大鼠術(shù) 天基本活動能力與正常大鼠無差別。但 SNI 組大鼠術(shù)側(cè)足在形狀、步態(tài)和姿與 O 組大鼠相比有差異，而 S 組大鼠與 O 組大鼠相比，其動情況、行走步姿勢均無明顯改變。如圖，SNI 組大鼠術(shù)后 3 天可見右側(cè)足形態(tài)異常，表現(xiàn)為足輕度外翻，運以左足為主，右足輕落在地上或不敢著地，刺激后出現(xiàn)縮足或舔足動作。

圖 3-1 三組大鼠 50%縮足閾值比較曲線圖：成年 SD 大鼠分為三組，SNI 模型組，S 組為假手術(shù)組，N 組為正常組。通過 von用 Up and Down 方法測定術(shù)后 50%縮足閾值。***P＜0.001vs S 組；**P<0.05vs S 組###P<0.0001vs N 組。3-2 Western Blot 檢測 SNI 模型大鼠不同天數(shù)全蛋白亞硝基化變化水平
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 汪達麗;張雙雙;劉建中;;蛋白質(zhì)亞硝基化檢測和鑒定方法的研究進展[J];植物生理學(xué)報;2014年08期

2 陳暢;黃波;韓佩韋;段紹瑾;;蛋白質(zhì)巰基亞硝基化——一種典型氧化還原依賴的蛋白質(zhì)翻譯后修飾[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2006年07期

本文編號：2857783