目的本研究旨在證實(shí)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma NB)細(xì)胞中LSD1促進(jìn)β-catenin在胞質(zhì)中堆積,證實(shí)LSD1通過激活Wnt通路,從而引起NB細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,并為進(jìn)一步探索其分子機(jī)制提供理論及實(shí)驗(yàn)支持。方法Western Blot方法分別檢測(cè)LSD1在NB細(xì)胞株SH-SY5Y細(xì)胞、人上皮細(xì)胞、大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)。將NB細(xì)胞株SH-SY5Y細(xì)胞分為三組:A組為L(zhǎng)SD1過表達(dá)組,轉(zhuǎn)染LSD1慢病毒載體組,SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)LSD1表達(dá)上調(diào);B組對(duì)照組為轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒,SH-SY5Y細(xì)胞中的LSD1與β-catenin的表達(dá)量未受到干擾;C為L(zhǎng)SD1干擾組,本組SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的LSD1活性被反苯環(huán)丙胺抑制劑(TCP)抑制。利用Quantitative real-time PCR(qPCR)方法分別檢測(cè)三組細(xì)胞中LSD1的表達(dá)情況及慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率。Western blot方法檢測(cè)并三組細(xì)胞中LSD1及β-catenin的表達(dá)并分析二者的表達(dá)關(guān)系。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)在SH-SY5Y細(xì)胞中調(diào)控LSD1表達(dá)后β-catenin的變化。結(jié)果人上皮細(xì)胞、大鼠神經(jīng)元細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞中LSD1的表達(dá)有顯著區(qū)別,人上皮細(xì)胞、大鼠神經(jīng)元細(xì)胞、SH-SY5Y細(xì)胞三者Western Blot的灰度值分別為133.87±10.54;135.00±12.48;192.00±13.23,三組進(jìn)行單因素方差分析無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);建立lsd1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株前后,SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)LSD1量有變化,通過qPCR對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞株中的lsd1的相對(duì)量進(jìn)行檢測(cè),A組、B組C組qPCR的閾值循環(huán)數(shù)分別為13.216±0.137、17.330±1.166、22.003±0.320三組進(jìn)行單因素方差分析p﹤0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Western Blot結(jié)果顯示,A組、B組、C組LSD1的灰度值為131.42±11.45、236.82±13.94、105.58±12.53,p﹤0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;A組、B組、C組β-catenin的表達(dá)灰度值為137.82±10.99、218.53±13.22、118.58±12.66,p﹤0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;調(diào)控LSD1表達(dá)后,SH-SY5Y細(xì)胞中β-catenin在胞質(zhì)中的堆積量明顯變化,LSD1表達(dá)上下調(diào)控后,β-catenin在胞質(zhì)中的堆積量隨之上下變化。(不同組間數(shù)據(jù)相關(guān)性檢驗(yàn)r=0.99,p﹤0.01);免疫組化染色結(jié)果為A組免疫組化染色,胞質(zhì)為棕色,表明β-catenin在胞質(zhì)中大量堆積;B免疫組化染色,胞質(zhì)為淺棕色,表明有一定量的β-catenin在胞質(zhì)中堆積,但堆積量量不如LSD1高表達(dá)組明顯;C組胞質(zhì)不著色,表明β-catenin在胞質(zhì)中的堆積量較少。結(jié)論在NB細(xì)胞株SH-SY5Y細(xì)胞中,LSD1的表達(dá)上調(diào),初步實(shí)驗(yàn)表明,在NB細(xì)胞中LSD1的表達(dá)水平較正常神經(jīng)元細(xì)胞及上皮細(xì)胞要高;進(jìn)一步推測(cè)其生物學(xué)活性,在NB細(xì)胞中β-catenin在胞質(zhì)中的堆積量與LSD1表達(dá)量呈正相關(guān)。β-catenin蛋白是Wnt通路的關(guān)鍵因子,LSD1通過增加β-catenin在胞質(zhì)中的堆積量進(jìn)而激活Wnt通路從而影響NB細(xì)胞的生物學(xué)活性。意義本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了lsd1穩(wěn)轉(zhuǎn)的NB細(xì)胞株,可供下一步實(shí)驗(yàn)繼續(xù)使用。證實(shí)了在NB細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞株中,LSD1高表達(dá),并且經(jīng)過驗(yàn)證其生物學(xué)活性,得知在NB細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞株中β-catenin在胞質(zhì)中的堆積量與LSD1的表達(dá)的呈正相關(guān)。推測(cè)出LSD1通過上調(diào)β-catenin在細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)一步影響NB的生物學(xué)活性。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

結(jié)果結(jié)果1 不同細(xì)胞中 LSD1 的表達(dá)情況利用 Western Blot 方法檢測(cè)人上皮細(xì)胞、大鼠神經(jīng)元細(xì)胞、SH-SY5Y 細(xì)胞中 L的表達(dá)量，人上皮細(xì)胞、大鼠神經(jīng)元細(xì)胞、SH-SY5Y 細(xì)胞三者 Western Blot 的值分別為 133.87±10.54;135.00±12.48;192.00±13.32,三組進(jìn)行單因素方差分析，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）；人上皮細(xì)胞、SH-SY5Y 細(xì)胞中 LSD1 的表達(dá)，兩樣本均數(shù) t 檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；大鼠神經(jīng)元細(xì)胞、SH-S細(xì)胞兩組間進(jìn)行兩樣本均數(shù) t 檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。說明 NB 中 LSD1 的表達(dá)量高于人上皮細(xì)胞及大鼠神經(jīng)元細(xì)胞。（見圖 1）

圖 2 起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)Fig 2 The logarithm of the initial copy number3 調(diào)控 LSD1 表達(dá)后，SH-SY5Y 中 LSD1 表達(dá)量的變化在 SH-SY5Y 細(xì)胞系中，成功敲除 lsd1，通過 PCR 檢測(cè)構(gòu)建質(zhì)粒和寡核苷酸鏈的有效性并轉(zhuǎn)染 SH-SY5Y 細(xì)胞系；然后通過 Western Blot、免疫熒光、免疫組化等方法來確定,β-catenin 在胞質(zhì)中的堆積量的變化。Western Blot 結(jié)果顯示，處理后的 SH-SY5Y 細(xì)胞中 LSD1 的表達(dá)量，A 組、B 組、C 組分別為236.82 13.94、131.42 11.45、105.58 12.53，三組進(jìn)行單因素方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，P<0.01)。（見圖 3）

圖 2 起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)Fig 2 The logarithm of the initial copy number1 表達(dá)后，SH-SY5Y 中 LSD1 表達(dá)量的變化Y5Y 細(xì)胞系中，成功敲除 lsd1，通過 PCR 檢測(cè)構(gòu)建質(zhì)粒性并轉(zhuǎn)染 SH-SY5Y 細(xì)胞系；然后通過 Western Blot、免疫來確定,β-catenin 在胞質(zhì)中的堆積量的變化。Western Blot SH-SY5Y 細(xì)胞中 LSD1 的表達(dá)量，A 組、B 組、C 組131.42 11.45、105.58 12.53，三組進(jìn)行單因素方差分析差001，P<0.01)。（見圖 3）
【參考文獻(xiàn)】

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2 鹿洪亭;董蒨;高強(qiáng);郝希偉;宋華;趙楠;;神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系裸鼠轉(zhuǎn)移模型及局部皮下荷瘤模型的建立[J];中華腫瘤雜志;2010年04期

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本文編號(hào)：2855553