起源于人類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的惡性腫瘤叫做神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤,簡(jiǎn)稱膠質(zhì)瘤,是人類神經(jīng)系統(tǒng)惡性程度較高的疾病之一,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中約占80%以上。根據(jù)國(guó)家癌癥中心2017年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)神經(jīng)系統(tǒng)每年新發(fā)腫瘤病人為95,900人,死亡病人達(dá)55,100人。由于膠質(zhì)瘤具有高度的增殖能力、侵襲性等特點(diǎn),目前標(biāo)準(zhǔn)治療方案(即開顱手術(shù)切除聯(lián)合放射治療和化學(xué)藥物治療)仍難以達(dá)到治愈效果,因此進(jìn)一步揭示膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制,尋找并探求治療膠質(zhì)瘤的有效靶點(diǎn)是當(dāng)下亟待解決的難題。眾所周知,膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是受多基因、多因素共同調(diào)控的,相關(guān)因子的異常表達(dá)都有可能引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞功能性的改變,進(jìn)而參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展全過(guò)程。本研究以尋找影響膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白或基因?yàn)槌霭l(fā)點(diǎn),深入探討其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞功能的調(diào)控及調(diào)控的具體分子機(jī)制。本研究旨在探明中長(zhǎng)鏈非編碼RNA LYPLAL1-2(Long non coding RNA lysophospholipase-like l-2,LncRNA-LYPLALl-2,LYPLAL 1-2)在大腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)量及其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演的角色,從而為治療膠質(zhì)瘤提供有效的治療新思路。本研究首先通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)創(chuàng)建并維護(hù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO數(shù)據(jù)庫(kù)),進(jìn)行生物信息學(xué)分析并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),分析得出具有表達(dá)差異較顯著的LYPLAL 1-2,非編碼小分子RNA-217-5p(miR-217-5p)和趨化因子受體7(CCR7)之間的關(guān)系,即LncRNA LYPLAL l-2通過(guò)miR-217-5p調(diào)控CCR7的表達(dá),進(jìn)而抑制腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)收集55例通過(guò)病理確診的大腦膠質(zhì)瘤病人的腫瘤組織和瘤周組織,提取RNA進(jìn)行qRT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄定量PCR),檢測(cè)結(jié)果顯示,膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LYPLAL1-2的表達(dá)量明顯降低。對(duì)膠質(zhì)瘤不同級(jí)別之間LYPLAL1-2的表達(dá)進(jìn)行分析,級(jí)別越高,LYPLAL1-2的表達(dá)量顯著下降。同時(shí)通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LYPLAL1-2過(guò)表達(dá)能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。進(jìn)一步通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)證實(shí),裸鼠采用皮下注射成瘤方法注射OEC(慢病毒載體構(gòu)建的U87空白對(duì)照組)或OE-LYPLAL1-2(慢病毒載體構(gòu)建的U87過(guò)表達(dá)LYPLAL1-2組),取腫瘤組織進(jìn)行大小檢測(cè),發(fā)現(xiàn)LYPLAL1-2過(guò)表達(dá)能顯著抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)。最后,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Western blot等實(shí)驗(yàn)并結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,LYPLAL1-2靶向負(fù)調(diào)控miR-217-5p,進(jìn)而調(diào)控CCR7表達(dá)。由此,得出結(jié)論LYPLAL 1-2通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-217-5p使CCR7表達(dá)減少,進(jìn)而抑制惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展。此外,本研究還證實(shí)TGF-β1(transforming growth factor-(3,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用,并以CCR7為中心,深入闡明CCR7調(diào)控TGF-β1介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞功能的具體分子機(jī)制。此部分研究利用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞株(U251和U87,人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞和人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞),將其分別培養(yǎng)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含TGF-βl的培養(yǎng)基中6 h,12 h,24 h,再采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上皮相關(guān)標(biāo)志物E鈣黏蛋白(E-cadherin),間質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物N鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)。E鈣黏蛋白,N鈣黏蛋白和波形蛋白是可以衡量腫瘤細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(eβithelial-mesenchymal transition EMT)水平的蛋白。當(dāng)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生時(shí),N-cadherin和波形蛋白(Vimentin)表達(dá)上調(diào),而E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,TGF-βl可使U251細(xì)胞和U87細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)降低,N-cadherin和Vimentin的表達(dá)上升,從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EMT的發(fā)生。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中觀察到TGF-β1能明顯加快細(xì)胞的遷移和侵襲速度。將U251和U87細(xì)胞分別用TGF-β1處理,通過(guò)轉(zhuǎn)染小干擾RNA(CCR7 siRNA,抑制CCR7表達(dá))和CCR7中和抗體(Ab CCR7,中和CCR7蛋白,降低CCR7蛋白水平)處理,分組為對(duì)照(Con)組,TGF-β1組,si CCR7+TGF-βl組,Ab CCR7+TGF-β1組。免疫印跡法結(jié)果顯示,TGF-β1處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CCR7的表達(dá)相較未處理組明顯上升。而CCR7干擾的細(xì)胞即使給予TGF-ββl處理(即si CCR7+TGF-βl組)相比只給予TGF-β1處理,E-cadherin的表達(dá)呈增加趨勢(shì),而N-cadherin和Vimentin的表達(dá)下降,即表明抑制了EMT。將以上分組進(jìn)行細(xì)胞增殖,遷移和侵襲實(shí)驗(yàn),觀察到TGF-β1能促進(jìn)細(xì)胞增殖,遷移和侵襲作用,也會(huì)因CCR7的表達(dá)降低而減慢。另外,細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),CCR7影響TGF-β1介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。TGF-ββ1使膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的阻滯效應(yīng)減弱。而抑制CCR7表達(dá)可逆轉(zhuǎn)TGF-β1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期阻滯的減弱效應(yīng)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示TGF-β1使膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MMP2/9(matrix metalloβroteinase基質(zhì)金屬蛋白2/9)的表達(dá)增加,而干擾CCR7減弱TGF-β1對(duì)MMP2/9表達(dá)的促進(jìn)作用。MMP2/9活性的改變與MMP2/9表達(dá)水平的改變一致,即TGF-β1處理后MMP2/9的活性增強(qiáng),當(dāng)CCR7低表達(dá)時(shí),TGF-β1對(duì)MMP2/9活性的增強(qiáng)作用減弱。由此證明,TGF-β1通過(guò)上調(diào)CCR7的表達(dá)增強(qiáng)MMP2/9的活性,促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲。此外,本研究的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示,TGF-β1 處理后NF-KB p65(Nuclear factor KB p65,核因子-KB p65)的表達(dá)明顯增加,且干擾CCiR7后,會(huì)降低此效應(yīng)。進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí),NF-κ B p65的轉(zhuǎn)錄受MMP2/9(順式作用元件)調(diào)控。綜合以上數(shù)據(jù),得出結(jié)論TGF-β1通過(guò)調(diào)控CCR7進(jìn)而激活MMP2/9,而MMP2/9作為順式作用元件調(diào)控NF-κ B p65進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲。綜上所述,本項(xiàng)目得出結(jié)論,LYPLAL 1-2通過(guò)調(diào)控miR-217-5p/CCR7抑制惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤,而CCR7可通過(guò)MMP2/9和NF-κB通路調(diào)控TGF-ββl介導(dǎo)的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤生物學(xué)功能。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

例）和ｍｉＲＮＡ的測(cè)序數(shù)據(jù)（包括ｎｏｒｍａｌ樣本５例，ＬＧＧ樣本５２５例）進(jìn)行分??析。另外，應(yīng)用ｈ＿ｍｉｍａ＿８ｘｌ５ｋ實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)ｎｏｒｍａｌ樣本１０例，ＧＢＭ樣本５６３??例的ｍｉＲＮＡ的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。??將數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化后處理后，并根據(jù)設(shè)定的閾值條件（ｐ＜〇．〇５，?｜ｌ〇ｇＦＣ｜＞ｌ），??獲得差異表達(dá)ｍＲＮＡ的熱圖和火山圖，獲得差異ｍｉＲＮＡ的火山圖，見圖１和２。??一？?—

?山東大學(xué)博士學(xué)位論文???３．２?ＣＣＲ７基因的ＫＥＧＧ分析??基于測(cè)序數(shù)據(jù)的ＣＣＲ７的表達(dá)值，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道ＣＣＲ７在腫瘤細(xì)胞ＥＭＴ??形成及腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，本研究將關(guān)注點(diǎn)集中在ＣＣＲ７上。對(duì)ＣＣＲ７的表達(dá)值??做ＧＳＥＡ分析，旨在獲得ＣＣＲ７的正向相關(guān)基因和負(fù)向相關(guān)基因，以及ＣＣＲ７??可能參與調(diào)控的通路。??以ＫＥＧＧ特征基因集合作為富集背景，將ＣＣＲ７的表達(dá)值作為表型文件，分??別計(jì)算每個(gè)基因和ＣＣＲ７的Ｐｅａｒｓｏｎ相關(guān)系數(shù)；并將ＣＣＲ７與其它基因的相關(guān)系??數(shù)（不取絕對(duì)值）進(jìn)行降序排序，作為掃描排序序列，進(jìn)行富集分析。設(shè)閾值為??ＮＯＭ／？ｖａｌ＜０．０５，得至丨Ｊ負(fù)相關(guān)特征基因集合１個(gè)：ＴＡＳＴＥ＿ＴＲＡＮＳＤＵＣＴＩＯＮ，??正相關(guān)特征基因集合３３個(gè)。??

３．３對(duì)目的ｍｉＲＮＡ和ｍＲＮＡ的表達(dá)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析??結(jié)合文獻(xiàn)和差異表達(dá)分析結(jié)果，提取ｍｉＲＮＡ－２１７－５ｐ和基因ＣＣＲ７在ＴＣＧＡ??中的表達(dá)值，然后分別做ｎｏｒｍａｌ?ｖｓ．?ＬＧＧ?ｖｓ．?ＧＢＭ表達(dá)箱線圖，見圖４。??－?８?°??Ｏ??ｗ?＿?〇??ｏｉ??〇??８?〇??〇?ｏ?°??－＾?■?Ｏ??．１?０??１?ｓ?了??３＂—?Ｉ?丨??§?－?Ｉ?＾??＿?Ｉ??ｑ?＿?：?—■—??Ｉ?Ｉ?Ｉ??ｎｏｒｍａｌ?ＬＧＧ?ＧＢＭ??ＳＴＡＧＥ??ｌ?Ｈ?８??Ｉ?〇??ｆ?１??Ｉ－?＾?１??ｉ?＝??Ｉ?Ｉ?ｉ??ｘ?Ｑ．?００?－??Ｉ?＾－１?卜?＿??ＣＭ?－??ｍ??２?￣?〇?－?°??ｉ?ｉ??１?１???ｎｏｒｍａｌ?ＧＢＭ?ｎｏｒｍａｌ?ＬＧＧ??ＳＴＡＧＥ?ＳＴＡＧＥ??圖４．不同程度的ＧＢＭ中目的ｍｉＲＮＡ和ｍＲＮＡ表達(dá)情況。上圖為ＣＣＲ７的箱??線圖，下圖（左）為ｈｓａ－ｍｉＲ－２１７－５ｐ在ＧＢＭ－ｎｏｒｍａｌ的箱線圖，下圖（右）為??ｈｓａ－ｍｉＲ－２１７－５ｐ?在?ＬＧＧ－ｎｏｒｍａ丨的箱線圖。??３．４?ｍｉＲＮＡ靶基因預(yù)測(cè)??利用預(yù)測(cè)工具ｍｉＲｗａｌｋ［６］，預(yù)測(cè)ＣＣＲ７的靶向ｍｉＲＮＡ和ＬＹＰＬＡＬ１－２的靶??向ｍｉＲＮＡ。鑒于存在差異的ｍｉＲＮＡ數(shù)量多，本研宄只提取了差異排名前３０的??ｍｉＲＮＡ
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本文編號(hào)：2851845