起源于人類神經(jīng)膠質(zhì)細胞的惡性腫瘤叫做神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤,簡稱膠質(zhì)瘤,是人類神經(jīng)系統(tǒng)惡性程度較高的疾病之一,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中約占80%以上。根據(jù)國家癌癥中心2017年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,我國神經(jīng)系統(tǒng)每年新發(fā)腫瘤病人為95,900人,死亡病人達55,100人。由于膠質(zhì)瘤具有高度的增殖能力、侵襲性等特點,目前標準治療方案(即開顱手術(shù)切除聯(lián)合放射治療和化學藥物治療)仍難以達到治愈效果,因此進一步揭示膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制,尋找并探求治療膠質(zhì)瘤的有效靶點是當下亟待解決的難題。眾所周知,膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是受多基因、多因素共同調(diào)控的,相關(guān)因子的異常表達都有可能引起膠質(zhì)瘤細胞功能性的改變,進而參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展全過程。本研究以尋找影響膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白或基因為出發(fā)點,深入探討其對膠質(zhì)瘤細胞功能的調(diào)控及調(diào)控的具體分子機制。本研究旨在探明中長鏈非編碼RNA LYPLAL1-2(Long non coding RNA lysophospholipase-like l-2,LncRNA-LYPLALl-2,LYPLAL 1-2)在大腦膠質(zhì)瘤中的表達量及其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演的角色,從而為治療膠質(zhì)瘤提供有效的治療新思路。本研究首先通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)創(chuàng)建并維護的基因表達數(shù)據(jù)庫(GEO數(shù)據(jù)庫),進行生物信息學分析并結(jié)合相關(guān)文獻,分析得出具有表達差異較顯著的LYPLAL 1-2,非編碼小分子RNA-217-5p(miR-217-5p)和趨化因子受體7(CCR7)之間的關(guān)系,即LncRNA LYPLAL l-2通過miR-217-5p調(diào)控CCR7的表達,進而抑制腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。同時收集55例通過病理確診的大腦膠質(zhì)瘤病人的腫瘤組織和瘤周組織,提取RNA進行qRT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄定量PCR),檢測結(jié)果顯示,膠質(zhì)瘤細胞中LYPLAL1-2的表達量明顯降低。對膠質(zhì)瘤不同級別之間LYPLAL1-2的表達進行分析,級別越高,LYPLAL1-2的表達量顯著下降。同時通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn),LYPLAL1-2過表達能顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲能力。進一步通過在體實驗證實,裸鼠采用皮下注射成瘤方法注射OEC(慢病毒載體構(gòu)建的U87空白對照組)或OE-LYPLAL1-2(慢病毒載體構(gòu)建的U87過表達LYPLAL1-2組),取腫瘤組織進行大小檢測,發(fā)現(xiàn)LYPLAL1-2過表達能顯著抑制膠質(zhì)瘤生長。最后,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖estern blot等實驗并結(jié)合生物信息學分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細胞中,LYPLAL1-2靶向負調(diào)控miR-217-5p,進而調(diào)控CCR7表達。由此,得出結(jié)論LYPLAL 1-2通過負調(diào)控miR-217-5p使CCR7表達減少,進而抑制惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展。此外,本研究還證實TGF-β1(transforming growth factor-(3,轉(zhuǎn)化生長因子-β1)對膠質(zhì)瘤細胞侵襲的促進作用,并以CCR7為中心,深入闡明CCR7調(diào)控TGF-β1介導的膠質(zhì)瘤細胞功能的具體分子機制。此部分研究利用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞細胞株(U251和U87,人神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤細胞和人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤細胞),將其分別培養(yǎng)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含TGF-βl的培養(yǎng)基中6 h,12 h,24 h,再采用免疫印跡實驗檢測上皮相關(guān)標志物E鈣黏蛋白(E-cadherin),間質(zhì)相關(guān)標志物N鈣黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表達。E鈣黏蛋白,N鈣黏蛋白和波形蛋白是可以衡量腫瘤細胞上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(eβithelial-mesenchymal transition EMT)水平的蛋白。當上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生時,N-cadherin和波形蛋白(Vimentin)表達上調(diào),而E-cadherin蛋白表達下調(diào)。實驗結(jié)果顯示,TGF-βl可使U251細胞和U87細胞的E-cadherin表達降低,N-cadherin和Vimentin的表達上升,從而促進膠質(zhì)瘤細胞的EMT的發(fā)生。Transwell遷移和侵襲實驗中觀察到TGF-β1能明顯加快細胞的遷移和侵襲速度。將U251和U87細胞分別用TGF-β1處理,通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA(CCR7 siRNA,抑制CCR7表達)和CCR7中和抗體(Ab CCR7,中和CCR7蛋白,降低CCR7蛋白水平)處理,分組為對照(Con)組,TGF-β1組,si CCR7+TGF-βl組,Ab CCR7+TGF-β1組。免疫印跡法結(jié)果顯示,TGF-β1處理的膠質(zhì)瘤細胞中CCR7的表達相較未處理組明顯上升。而CCR7干擾的細胞即使給予TGF-ββl處理(即si CCR7+TGF-βl組)相比只給予TGF-β1處理,E-cadherin的表達呈增加趨勢,而N-cadherin和Vimentin的表達下降,即表明抑制了EMT。將以上分組進行細胞增殖,遷移和侵襲實驗,觀察到TGF-β1能促進細胞增殖,遷移和侵襲作用,也會因CCR7的表達降低而減慢。另外,細胞周期實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),CCR7影響TGF-β1介導的膠質(zhì)瘤細胞的細胞周期進程。TGF-ββ1使膠質(zhì)瘤細胞周期的阻滯效應減弱。而抑制CCR7表達可逆轉(zhuǎn)TGF-β1對膠質(zhì)瘤細胞周期阻滯的減弱效應。Western blot實驗結(jié)果則顯示TGF-β1使膠質(zhì)瘤細胞中MMP2/9(matrix metalloβroteinase基質(zhì)金屬蛋白2/9)的表達增加,而干擾CCR7減弱TGF-β1對MMP2/9表達的促進作用。MMP2/9活性的改變與MMP2/9表達水平的改變一致,即TGF-β1處理后MMP2/9的活性增強,當CCR7低表達時,TGF-β1對MMP2/9活性的增強作用減弱。由此證明,TGF-β1通過上調(diào)CCR7的表達增強MMP2/9的活性,促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖,遷移和侵襲。此外,本研究的酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果顯示,TGF-β1 處理后NF-KB p65(Nuclear factor KB p65,核因子-KB p65)的表達明顯增加,且干擾CCiR7后,會降低此效應。進一步通過qRT-PCR(實時熒光定量PCR)和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實,NF-κ B p65的轉(zhuǎn)錄受MMP2/9(順式作用元件)調(diào)控。綜合以上數(shù)據(jù),得出結(jié)論TGF-β1通過調(diào)控CCR7進而激活MMP2/9,而MMP2/9作為順式作用元件調(diào)控NF-κ B p65進而促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖,遷移和侵襲。綜上所述,本項目得出結(jié)論,LYPLAL 1-2通過調(diào)控miR-217-5p/CCR7抑制惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤,而CCR7可通過MMP2/9和NF-κB通路調(diào)控TGF-ββl介導的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤生物學功能。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

例）和ｍｉＲＮＡ的測序數(shù)據(jù)（包括ｎｏｒｍａｌ樣本５例，ＬＧＧ樣本５２５例）進行分??析。另外，應用ｈ＿ｍｉｍａ＿８ｘｌ５ｋ實驗方法，對ｎｏｒｍａｌ樣本１０例，ＧＢＭ樣本５６３??例的ｍｉＲＮＡ的芯片數(shù)據(jù)進行分析。??將數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化后處理后，并根據(jù)設(shè)定的閾值條件（ｐ＜〇．〇５，?｜ｌ〇ｇＦＣ｜＞ｌ），??獲得差異表達ｍＲＮＡ的熱圖和火山圖，獲得差異ｍｉＲＮＡ的火山圖，見圖１和２。??一？?—

?山東大學博士學位論文???３．２?ＣＣＲ７基因的ＫＥＧＧ分析??基于測序數(shù)據(jù)的ＣＣＲ７的表達值，并結(jié)合文獻報道ＣＣＲ７在腫瘤細胞ＥＭＴ??形成及腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，本研究將關(guān)注點集中在ＣＣＲ７上。對ＣＣＲ７的表達值??做ＧＳＥＡ分析，旨在獲得ＣＣＲ７的正向相關(guān)基因和負向相關(guān)基因，以及ＣＣＲ７??可能參與調(diào)控的通路。??以ＫＥＧＧ特征基因集合作為富集背景，將ＣＣＲ７的表達值作為表型文件，分??別計算每個基因和ＣＣＲ７的Ｐｅａｒｓｏｎ相關(guān)系數(shù)；并將ＣＣＲ７與其它基因的相關(guān)系??數(shù)（不取絕對值）進行降序排序，作為掃描排序序列，進行富集分析。設(shè)閾值為??ＮＯＭ／？ｖａｌ＜０．０５，得至丨Ｊ負相關(guān)特征基因集合１個：ＴＡＳＴＥ＿ＴＲＡＮＳＤＵＣＴＩＯＮ，??正相關(guān)特征基因集合３３個。??

３．３對目的ｍｉＲＮＡ和ｍＲＮＡ的表達值進行統(tǒng)計分析??結(jié)合文獻和差異表達分析結(jié)果，提�。恚椋遥危粒玻保罚担鸷突颍茫茫遥吩冢裕茫牵�??中的表達值，然后分別做ｎｏｒｍａｌ?ｖｓ．?ＬＧＧ?ｖｓ．?ＧＢＭ表達箱線圖，見圖４。??－?８?°??Ｏ??ｗ?＿?〇??ｏｉ??〇??８?〇??〇?ｏ?°??－＾?■?Ｏ??．１?０??１?ｓ?了??３＂—?Ｉ?丨??§?－?Ｉ?＾??＿?Ｉ??ｑ?＿?：?—■—??Ｉ?Ｉ?Ｉ??ｎｏｒｍａｌ?ＬＧＧ?ＧＢＭ??ＳＴＡＧＥ??ｌ?Ｈ?８??Ｉ?〇??ｆ?１??Ｉ－?＾?１??ｉ?＝??Ｉ?Ｉ?ｉ??ｘ?Ｑ．?００?－??Ｉ?＾－１?卜?＿??ＣＭ?－??ｍ??２?￣?〇?－?°??ｉ?ｉ??１?１???ｎｏｒｍａｌ?ＧＢＭ?ｎｏｒｍａｌ?ＬＧＧ??ＳＴＡＧＥ?ＳＴＡＧＥ??圖４．不同程度的ＧＢＭ中目的ｍｉＲＮＡ和ｍＲＮＡ表達情況。上圖為ＣＣＲ７的箱??線圖，下圖（左）為ｈｓａ－ｍｉＲ－２１７－５ｐ在ＧＢＭ－ｎｏｒｍａｌ的箱線圖，下圖（右）為??ｈｓａ－ｍｉＲ－２１７－５ｐ?在?ＬＧＧ－ｎｏｒｍａ丨的箱線圖。??３．４?ｍｉＲＮＡ靶基因預測??利用預測工具ｍｉＲｗａｌｋ［６］，預測ＣＣＲ７的靶向ｍｉＲＮＡ和ＬＹＰＬＡＬ１－２的靶??向ｍｉＲＮＡ。鑒于存在差異的ｍｉＲＮＡ數(shù)量多，本研宄只提取了差異排名前３０的??ｍｉＲＮＡ
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本文編號：2851845