膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是侵潤(rùn)性強(qiáng)、惡性度高的致死性成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。對(duì)放療和化療均耐受。因侵潤(rùn)性較強(qiáng),手術(shù)不能達(dá)到全切。盡管膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的診療和基礎(chǔ)研究已經(jīng)取得顯著進(jìn)展,但臨床患者預(yù)后仍極不理想,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的靶向治療急待進(jìn)一步發(fā)掘。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。主要通過(guò)與抗氧化順式作用元件結(jié)合以調(diào)控ARE控制基因的表達(dá)。ARE控制基因包括抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因、多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。除了介導(dǎo)抗氧化酶基因和解毒基因的表達(dá),Nrf2還可廣泛地調(diào)控細(xì)胞的多種代謝,如抑制脂肪合成,促進(jìn)脂肪酸β氧化,促進(jìn)磷酸戊糖代謝,增加GSH生成、NADPH再生和嘌呤生物合成。Nrf2和Nrf2調(diào)控的下游基因?qū)p輕或消除毒物、致癌物的毒性作用至關(guān)重要,給予天然或人工合成化合物激活Nrf2通路,可發(fā)揮解除毒物、致癌物毒性的作用。然而,最近不斷增加的研究表明核因子Nrf2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的病理生理過(guò)程中具有"黑暗"的一面:Nrf2和其調(diào)控的下游基因在許多腫瘤細(xì)胞或組織中高表達(dá),并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存和增殖。此外,Nrf2可增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療藥物的耐受性,是腫瘤耐藥的重要原因。我們將研究核因子Nrf2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和耐藥中所發(fā)揮的作用,并從細(xì)胞代謝角度闡明Nrf2發(fā)揮促癌作用的機(jī)制。本課題共分成以下四個(gè)研究部分:第一部分核因子Nrf2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)模式及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響目的:研究核因子Nrf2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)模式及評(píng)估其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。方法:蛋白免疫印跡電泳和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)評(píng)估核因子Nrf2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)模式;慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA感染細(xì)胞下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Nrf2。細(xì)胞的增殖由CCK-8法評(píng)估。結(jié)果:和正常人腦星形細(xì)胞比較,四種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(U251、U87、A172和SHG44)中Nrf2均高表達(dá),其中U251細(xì)胞系的Nrf2表達(dá)水平最高,增殖速度也最快。通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的shRNA感染細(xì)胞可成功建立Nrf2穩(wěn)定下調(diào)的細(xì)胞系U251。核因子Nrf2下調(diào)后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線變平緩,平板克隆實(shí)驗(yàn)形成的克隆直徑變小,克隆形成減少。結(jié)論:和正常人腦星形細(xì)胞(NHA)比較,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的Nrf2均高表達(dá),其中U251細(xì)胞系Nrf2的表達(dá)水平最高。細(xì)胞內(nèi)核因子Nrf2的表達(dá)水平和細(xì)胞增殖速度呈正相關(guān)。慢病毒介導(dǎo)的shRNA感染細(xì)胞可成功建立Nrf2穩(wěn)定下調(diào)的細(xì)胞系。核因子Nrf2下調(diào)后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖明顯受到抑制。第二部分核因子Nrf2調(diào)控的能量代謝在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系增殖中的作用目的:研究Nrf2調(diào)控的能量代謝和能量代謝敏感AMPK-mTOR信號(hào)通路在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖中的作用。方法:慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA感染細(xì)胞下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Nrf2。細(xì)胞內(nèi)ATP水平通過(guò)螢火蟲(chóng)熒光素酶為基礎(chǔ)的熒光分光光度法檢測(cè)。細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值由高效液相色譜法檢測(cè)。細(xì)胞的增殖由CCK-8法評(píng)估。細(xì)胞內(nèi)AMPK-mTOR通路狀態(tài)由蛋白免疫印跡電泳評(píng)估。結(jié)果:核因子Nrf2下調(diào)后,細(xì)胞內(nèi)ATP水平明顯下降,AMP/ATP比值相應(yīng)顯著升高。并且核因子Nrf2下調(diào)后,細(xì)胞內(nèi)能量代謝敏感AMPK通路也激活。給予AMPK特異性激動(dòng)劑苯乙基雙胍可模擬核因子Nrf2下調(diào)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制和能量代謝障礙。結(jié)論:核因子Nrf2下調(diào)誘導(dǎo)的增殖抑制由能量代謝障礙和能量代謝敏感的AMPK通路激活所介導(dǎo)。第三部分核因子Nrf2依賴(lài)的GSH生成在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖中的作用目的:研究核因子Nrf2依賴(lài)的GSH生成在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖中的作用及機(jī)制。方法:慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA感染細(xì)胞下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Nrf2。細(xì)胞內(nèi)ROS水平由熒光分光光度法檢測(cè)。細(xì)胞內(nèi)GSH水平由分光光度法檢測(cè)。細(xì)胞的增殖由CCK-8法評(píng)估。細(xì)胞內(nèi)AKT、ERK1/2和STAT3活化狀態(tài)由蛋白免疫印跡電泳評(píng)估。結(jié)果:核因子Nrf2下調(diào)后,細(xì)胞內(nèi)GSH水平明顯下降,ROS水平相應(yīng)顯著升高。并且核因子Nrf2下調(diào)后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)曲線變平緩,平板克隆實(shí)驗(yàn)形成的克隆直徑變小,克隆形成減少。核因子Nrf2下調(diào)后,細(xì)胞內(nèi)AKT、ERK1/2活化水平受抑制(STAT3活化狀態(tài)變化不明顯)。外源性給予NAC可清除細(xì)胞內(nèi)升高的ROS,但不能恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)下降的GSH,也不能逆轉(zhuǎn)Nrf2下調(diào)誘導(dǎo)的增殖抑制,而外源性給予GSH可清除細(xì)胞內(nèi)升高的ROS,能恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)下降的GSH,還可顯著逆轉(zhuǎn)Nrf2下調(diào)誘導(dǎo)的增殖抑制。最后,給予AKT抑制劑(AKT inhibitor Ⅳ)、ERK1/2 抑制劑(U0126)和 STAT3 抑制劑(AG490),只有AKT抑制劑AKT inhibitor Ⅳ可對(duì)抗GSH的逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)論:細(xì)胞內(nèi)GSH水平下降和AKT通路抑制在核因子Nrf2下調(diào)誘導(dǎo)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖抑制中發(fā)揮重要作用。第四部分核因子Nrf2依賴(lài)的GSH生成在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TMZ耐藥中的作用目的:研究核因子Nrf2依賴(lài)的GSH生成在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤TMZ耐藥中的作用。方法:采用TMZ間歇濃度梯度遞增法誘導(dǎo)建立膠質(zhì)母細(xì)胞瘤耐藥細(xì)胞株U251TR和U87TR。CCK-8法評(píng)估耐藥細(xì)胞的IC50和耐藥指數(shù)。分光光度法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH水平。蛋白免疫印跡電泳檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)核因子Nrf2及GSH凈生成相關(guān)的多種酶(GCLC、GS和GR)的表達(dá)水平。慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA感染細(xì)胞下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Nrf2。CCK-8法評(píng)估替莫唑胺對(duì)耐藥細(xì)胞U251TR和U87TR的毒性和增殖抑制作用。結(jié)果:通過(guò)體外分步誘導(dǎo)法成功建立了對(duì)替莫唑胺具有穩(wěn)定耐藥性的U251TR和U87TR細(xì)胞株。CCK-8法檢測(cè)顯示U251TR的耐藥指數(shù)為10.92,U87TR的耐藥指數(shù)為10.35。耐藥細(xì)胞內(nèi)GSH明顯升高:U251TR較U251升高約3.7倍,U87TR較U87升高約2.4倍。蛋白免疫印跡電泳表明:在耐藥細(xì)胞內(nèi)核因子Nrf2及GSH凈生成相關(guān)酶(GCLC、GS和GR)表達(dá)上調(diào),而慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA下調(diào)TMZ耐藥細(xì)胞內(nèi)Nrf2后,TMZ耐藥細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)GSH水平明顯下降,U251TR和U87TR細(xì)胞內(nèi)GSH凈生成相關(guān)酶(GCLC、GS和GR)表達(dá)亦降低。最后,CCK-8法檢測(cè)表明:細(xì)胞內(nèi)Nrf2下調(diào)后,可逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的耐藥性,而外源性補(bǔ)充GSH可削弱替莫唑胺對(duì)耐藥細(xì)胞的毒性作用。結(jié)論:間歇TMZ濃度遞增法成功建立人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤耐藥性細(xì)胞株U251TR和U87TR。Nrf2依賴(lài)的GSH凈生成與TMZ耐藥性形成相關(guān)。
【學(xué)位單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類(lèi)】：R739.41
【部分圖文】：

??ＡＲＥ而激活該通路，見(jiàn)圖３。??曼＾?誠(chéng)曲舞器??Ｓ?蘭?ｓｔａｔｅ?ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ??’［Ｋ而－；早嗎；■■■１＾?Ｖ？＾??—＾?ＤＬＧ?ＥＴＧＥ?＾ＴＶ??Ｉ?駕子??ｕｎｄｅｒ?■?－＾＊－??ｉｎｄｕｃｅｄ?■??ｓｔａｔｅ?■??／＾Ｖ?＾??，?ＡＲＥ－ｄｒｉｖ＾ｎ?Ｏ＾ｎｅｔ??／?Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ??／?Ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ??（?＾＾＾９?Ｃｈａｐｅｒｏｎ？??Ｖ?＾?ｓＭｉｆＪＳ｜Ｈ＾?Ｉ?Ｐｒｏｔｅａｆｔｏｍｅ??＼?＼?＇ｉｉｉｆｆｌｉｇ＾ａ—Ｌ?Ｖ＿＾?Ｊ?ｙ??Ｎｕｄｅｕｓ?／??閱２：?Ｋｅａｐｌ對(duì)核因子Ｎｒｆ２的調(diào)控（該圖來(lái)源于Ｌｅｅ?ＤＨ，Ｇｏｌｄ艮，Ｌｉｎｋｅｒ?ＲＡ．?２０１２．??Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ?ｏｆ?ｏｘｉｄａｔｉｖｅ?ｄａｍａｇｅ?ｍｕｌｔｉｐｌｅ?ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ?ａｎｄ?ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ??ｄｉｓｅａｓｅｓ：化ｅｒａｐｅｕｔｉｃ?ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ?ｖｉａ?ｆｌｉｍａｒｉｃ?ａｄｄ?ｅｓ化ｒｓ．?Ｉｎｔ?Ｊ?Ｍｏｌ?Ｓｃｉ．?１３（９）：??１１７８３－８０３．）。??＾?ＪＮＫ?ＥＲＫ?ｐ３８?ｆ??／?％?１１?＾?ｉｔ??咬＞?，－ＳＥ＝?＝＝ｅｉＦ??＼?－一??Ｘ?ｃｏｒｅｇｕｌａｌｏｒｓ＾Ｍ?ＮＱＯＩ??鴻＾扉�。迯V；＾??＝ｊｃＣＡＡ下?／?ＸＲＥ?ＡＲＥ?ｐ?￣??圖３：信號(hào)通路對(duì)核因子Ｎ瓜的調(diào)控（該圖來(lái)源于Ｌｅｅ?ＪＳ

ｓｕｐｅｒｏｘｅｓｍ山ａｓｅ，，ｇｕｔａｔｏｎｅ?ｐｅｒｏ谷脫甘狀還原酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ?ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，?ＧＲ）等，這些抗氧化酶具有清保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基攻擊。第二類(lèi)是非酶類(lèi)抗氧化系統(tǒng)，如ＧＳ、微量元素砸等（其中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，ＧＳＨ是腦內(nèi)最有效的。而核因子Ｎｒ億既可調(diào)控抗氧化酶系統(tǒng)，亦可調(diào)控非酶類(lèi)抗氧化系ＲＥ通路是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路。??核因子Ｎｒｆ２調(diào)控多種抗氧化酶??ｒｆ２可調(diào)控多種抗氧化酶（見(jiàn)圏４），如過(guò)氧化氨酶（ｃａｔａｌａｓｅ，?ＣＡＴ），化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ?ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，?ＳＯＤ），谷腕甘狀過(guò)氧化物酶（ｇｌｕｔｉｄａｓｅ，?ＧＰｘ），谷脫甘狀還原酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ?ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，?ＧＲ）及胞質(zhì)硫氧ｏｓｏｌｉｃ?化ｉｏｒｅｄｏｘｉｎ，ＴＸＮ）?１，和硫氧還蛋白還原酶（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ?ｒｅＤ）?１等。這些多種抗氧化酶均可清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基或還原己經(jīng)的琉基。??＇＂－—

酸、半臘氨酸和甘氨酸）合成ＧＳＨ需經(jīng)兩步反應(yīng)，分別由ｙ－谷氨醜半脫氨酸??合成酶（丫－ＧＵ）和谷脫甘化合成酶（ＧＳＨＳ）催化。谷腕甘化再生（ＧＳＳＧ一ＧＳＨ）??由谷腕甘化還原酶（ＧＲ）催化（詳見(jiàn)圖５）。??ＧＳＳＧ???牛??Ｆ巧ｅ?巧ｄｉｃａｌｓ??？?＼（ｇｒｊ??ＧＳＨ?ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ?＾??ＧＳＨ＜???Ａ??Ｇｌｙｃｉｎｅ?？?——??Ｇｌｕ－Ｃｙｓ??個(gè)??Ｃｙｓｔｅｉｎｅ?—?—ＨＣ？）??Ｇｌｕｔａｍａｔｅ??圖５；從前體氨基酸合成谷脫甘化及谷耽甘狀再生，其中楠圓形標(biāo)記的酶為核因??子Ｎｒｆ２調(diào)控範(fàn)基因。??２．２?Ｎｒ口調(diào)控還原型輔酶ＩＩ?（ＮＡＤＰＨ）的合成和利用??Ｎｒｆ２調(diào)控的多種藥物代謝酶和抗氧化酶（如ＡＫＲ、ＮＱ０１、ＧＳＲ１、ＴＸＮＲＤ１??等），在發(fā)揮功能時(shí)需輔助因子還原型煙醜胺腺嘿咚二核昔酸碟酸（即還原型輔??酶ＩＩ，或ＮＡＤＰＨ）作為供氨體ｆｓ—Ｗ。??－１５－??
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本文編號(hào)：2850477