神經(jīng)母細(xì)胞瘤是常見于兒童的顱外腫瘤,是一種惡性程度和死亡率都較高的腫瘤,兒童發(fā)病率為10.5/10萬,在兒童所有腫瘤中的比例約為6-10%,卻占有約15%的兒童腫瘤死亡率。目前只要采用手術(shù)的方法來治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤,并輔以化療、放療等方式進(jìn)行治療。尋找新型有效毒副作用較小的化療藥物具有重要的意義。脫氧膽酸是一種次級(jí)膽汁酸,由膽酸在C-7位置上的一個(gè)羥基脫去氧生成,已有研究表明其對(duì)一些腫瘤具有抑制的作用。本論文將研究其對(duì)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的作用,以SHSY-5Y作為體外模型,在體外探究脫氧膽酸對(duì)其作用后所引起的細(xì)胞形態(tài)變化及其作用機(jī)理的研究。采用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法,用不同濃度的脫氧膽酸(DCA)處理SHSY-5Y細(xì)胞,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率;通過AO/EB、Hoechst染色用熒光顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;劃痕實(shí)驗(yàn)探究DCA對(duì)細(xì)胞遷移的影響;通過不同熒光染色的流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)DCA作用后細(xì)胞周期的分布、活性氧含量和以及細(xì)胞凋亡率;通過Western Blot和RT-PCR檢測(cè)DCA處理后相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化情況探討DCA作用的分子機(jī)制。結(jié)果表明,DCA作用能夠抑制SHSY-5Y細(xì)胞株的增殖,可以促進(jìn)細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放,可以使細(xì)胞形成克隆能力下降。通過形態(tài)學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)出細(xì)胞變圓皺縮、細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞核碎裂形成凋亡小體等凋亡特征性的形態(tài)學(xué)現(xiàn)象。劃痕實(shí)驗(yàn)表明,DCA作用下,細(xì)胞遷移能力降低。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡率、活性氧含量結(jié)果顯示,經(jīng)DCA誘導(dǎo)處理48h后,細(xì)胞周期在G2/M期所占比例顯著增多,細(xì)胞凋亡率明顯增大,細(xì)胞內(nèi)活性氧增加,均表現(xiàn)為濃度依賴性。0.8 mmol/LDCA處理48 h后SHSY-5Y處于G2/M期細(xì)胞由10.0%提升到41.5%,細(xì)胞凋亡率由1.46%提升至 51.81%。Western blot 和 RT-PCR 結(jié)果顯示,在 DCA 作用下,p21、p53、Bax等相關(guān)抑癌基因表達(dá)水平上調(diào),Bcl-2、Akt等相關(guān)致癌基因表達(dá)水平下調(diào),CDK1、CylinB1等周期蛋白表達(dá)量下降。從而我們可以得出基本結(jié)論,DCA作用下,通過影響p21、p53、CDK1、CylinB1等相關(guān)因子的表達(dá),可以將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期;通過影響B(tài)cl-2、Bax、Akt等蛋白的表達(dá)量進(jìn)而導(dǎo)致線粒體膜電位下降,膜通透性增加,進(jìn)而釋放Cytc到胞漿,與胞漿內(nèi)Apaf1結(jié)合,各因子之間級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大凋亡效應(yīng),下游凋亡執(zhí)行者Caspase被激活,引起SHSY-5Y細(xì)胞凋亡。綜上所述,DCA可以顯著抑制神經(jīng)母瘤細(xì)胞SHSY-5Y增殖,并呈濃度依賴關(guān)系;DCA處理后,使細(xì)胞周期被阻滯在G2/M期,并經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ＤＣＡ在０．２？１．０?ｍｍｏｌ／Ｌ濃度范圍內(nèi)對(duì)ＳＨＳＹ－５Ｙ細(xì)胞的增殖產(chǎn)??生抑制作用，抑制增殖效果隨著ＤＣＡ作用濃度的增加和ＤＣＡ作用時(shí)間的增加??而增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。結(jié)果見圖２所示。??１２〇ｉ?？?２４ｈ??＾?１〇〇ｎｉ?４８ｈ??＾?８０－?＼??｜?６。－??ｒ°－??°２〇－?，??０．０?０．２?０．４?０．６?０．８?１．０?１．２??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＤＣＡ（ｍＭ）??圖２?ＤＣＡ對(duì)ＳＨＳＹ－５Ｙ細(xì)胞的體外增殖的影響??Ｆｉｇ．?２?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｃｅｌｌ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ｂｙ?ＤＣＡ?ｉｎ?ＳＨＳＹ－５Ｙ?ｃｅｌｌｓ??４．２?ＤＣＡ對(duì)ＳＨＳＹ－５Ｙ細(xì)胞集落形成能力的影響??集落形成實(shí)驗(yàn)可以探宄腫瘤細(xì)胞在藥物作用下對(duì)形成克隆能力影響的方法。??用６０?ｍｍ培養(yǎng)皿接種細(xì)胞，每皿細(xì)胞約５００個(gè)，細(xì)胞貼壁后加ＤＣＡ處理２４?ｈ后??撤去ＤＣＡ，加入新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞形成肉眼可見克隆，最后通過??吉姆薩染色觀察拍照。實(shí)驗(yàn)得出，ＳＨＳＹ－５Ｙ細(xì)胞對(duì)照組所形成的克隆多并且比??較大，隨著ＤＣＡ作用濃度的增加，克隆數(shù)目和大小都減小。通過計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)出不??同濃度的ＤＣＡ作用下集落形成能力的變化如圖所示�？梢钥闯觯谀J(rèn)對(duì)照

隨著ＤＣＡ作用濃度的增加，ＬＤＨ活性逐漸增加，在０．６?ｍｍｏｌ／Ｌ的時(shí)候有一個(gè)??突增，為５９．２％，之后趨近與一個(gè)基本穩(wěn)定的值。說明，在較高濃度ＤＣＡ的作??用下，會(huì)使細(xì)胞膜破裂導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的ＬＤＨ釋放到細(xì)胞外。結(jié)果見圖４所示。??８０－１??一?—２４ｈ??工?６０－?????〇?４０－?／??＜Ｕ?／??２０－?／??益????０?￣ｙ??，?！?！?！?（??０．０?０．２?０．４?０．６?０．８?１．０?１．２??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＤＣＡ（ｍＭ）??圖４?ＤＣＡ對(duì)ＳＨＳＹ－５Ｙ細(xì)胞中ＬＤＨ釋放的影響??Ｆｉｇ．４?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ＤＣＡ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｒｅｌｅａｓｅ?ｏｆ?ＬＤＨ?ｉｎ?ＳＨＳＹ－５Ｙ?ｃｅｌｌｓ??４．４?ＤＣＡ作用對(duì)ＳＨＳＹ－５Ｙ細(xì)胞形態(tài)的影響??４．４．１倒置相差顯微鏡下觀察ＤＣＡ作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化??ＳＨＳＹ－５Ｙ細(xì)胞在ＤＣＡ作用４８?ｈ后，吉姆薩染色，倒置相差顯微鏡下觀察??并拍照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖５所示。正常的ＳＨＳＹ－５Ｙ細(xì)胞呈梭形或者不規(guī)則多邊形，??細(xì)胞形態(tài)飽滿，分布均勻（圖５?Ａ）；將不同濃度ＤＣＡ作用ＳＨＳＹ－５Ｙ細(xì)胞４８?ｈ??后，隨著ＤＣＡ濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，一??部分細(xì)胞生長(zhǎng)成梭形，而部分細(xì)胞變圓（圖５Ｄ），細(xì)胞數(shù)量和對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量明??顯減少

而ＰＣＮＡ主要的功能是參與了?Ｓ期的ＤＮＡ復(fù)制。這說明，在ＤＣＡ??的作用下，ＤＮＡ的復(fù)制可能并沒有受到直接的影響，Ｓ期正常進(jìn)行。這與我們流??式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的結(jié)果一致。結(jié)果見圖１０所示。??０?０．２?０．４?０．６?ｍｍｏｌ／Ｌ??ｐＣＮＡ?ｍｍｍｍ?＿?丨丨＿丨??（３－ａｃｔｉｎ??ｐｅｃｔｉｎ?ＰＣＮＡ??１．５－１?１．５－１??［〇—?隊(duì)翁．．．＂?１?°?．．．?＇！??Ｉ?＾?＾?Ｍ?Ｉ?條溆呤、?嘴??０５?ｍ?ｍ?ｍ?ｍ?°５?＿?麟?＿?…??ｒｏｌｌ?；?Ｉ?Ｉ?Ｉ?ｌ?ｌ?Ｉ?－?００ｌｋｙｄ?ｍｍ?Ｉ?ｖ：－ｍ．??＾?＾?。?＾?＾?＾??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＤＣＡ（ｍＭ）?Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＤＣＡ（ｍＶＩ）??圖１０?ＤＣＡ對(duì)ＳＨＳＹ－５Ｙ細(xì)胞ＰＣＮＡ蛋白表達(dá)的影響??Ｆｉｇ．?１０?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ＤＣＡ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｌｅｖｅｌ?ｏｆ?ＰＣＮＡ．??４２??
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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3 Curt Einarsson;Ewa Ellis;Anna Abrahamsson;Bo-Gran Ericzon;Ingemar Bjrkhem;Magnus Axelson;;Bile acid formation in primary human hepatocytes[J];World Journal of Gastroenterology;2000年04期

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本文編號(hào)：2849482