腦膠質瘤(Glioma)是最常見的中樞神經系統(tǒng)(CNS)的惡性腫瘤,其中最常見、惡性程度最高的是膠質母細胞瘤(GBM)。腦膠質瘤最根本、最有效的治療方式是最大范圍安全切除腫瘤輔以術后放化療。盡管近年來隨著免疫治療、基因治療等新治療方法不斷應用,腦膠質瘤的治療手段有了較大的進步,然而對其治療并未取得突破性進展,GBM患者的5年總生存率僅約5%,中位生存期僅約15個月。闡明腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制,探尋腦膠質瘤分子治療靶點是當前神經腫瘤研究的重點。本研究旨在通過組織芯片技術、免疫組織化學技術檢測TXLNA基因在腦膠質瘤中表達情況及其與腦膠質瘤患者預后的相關性,采用分子生物學及細胞生物學等技術方法探索TXLNA基因在腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學功能,為TXLNA基因成為腦膠質瘤臨床預后預測標志物以及分子靶向治療候選靶點提供依據。本課題組利用前期的基因表達譜芯片篩選出與腦膠質瘤患者預后顯著相關的83個基因,本研究選定TXLNA基因深入研究其對于GBM預后判斷的價值及其在腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。首先,我們從TCGA公共數(shù)據庫下載了10例正常腦組織樣本的基因表達數(shù)據和528例GBM樣本的基因表達數(shù)據及對應的臨床資料和隨訪數(shù)據,從中提取TXLNA基因的相關數(shù)據進行基因差異表達分析及生存分析,結果發(fā)現(xiàn)在GBM中TXLNA表達量較正常腦組織顯著上調(7.023±0.032 vs.5.284±0.0718,p0.0001),通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)TXLNA表達量與患者總生存期(OS)(p=0.0373)相關,與無進展生存期(PFS)(p=0.1360)相關性不顯著。在數(shù)據庫中初步驗證TXLNA在GBM中表達上調且與患者預后具有相關性的基礎上,本研究進一步收集了300例腦膠質瘤樣本及16例正常腦組織樣本,其中WHOⅠ級11例,WHOⅡ級109例,WHOⅢ級47例,WHOⅣ級133例;將上述樣本制備成組織芯片,對其中隨訪數(shù)據完整的共100例原發(fā)性GBM樣本及16例正常腦組織樣本的免疫組化結果進行判讀評分并統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)TXLNA在原發(fā)性GBM中表達較正常腦組織明顯上調(p=0.0189);將100例原發(fā)性GBM依據TXLNA免疫組化結果分為TXLNA高表達組66例(3分)和TXLNA低表達組34例(≤3分),通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn),TXLNA表達與原發(fā)性GBM患者OS(p=0.0006)和PFS(p=0.0001)均具有顯著相關性,且TXLNA高表達對應更短的OS和PFS。通過單因素分析將p值0.2的臨床因素進一步納入多因素Cox比例風險回歸模型,結果證實TXLNA高表達是原發(fā)GBM患者OS(HR=2.126,95%CI:1.293-3.497,p=0.003)及PFS(HR=2.530,95%CI:1.530-4.184,p0.001)的獨立預后危險因素。為了深入探討TXLNA在腦膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。本課題通過構建TXLNA基因的過表達質粒,包裝慢病毒后感染U251細胞和GBM原代細胞,建立TXLNA穩(wěn)定過表達細胞株;通過構建TXLNA敲除質粒,轉染U251細胞和GBM原代細胞并用流式細胞儀分選單克隆建立TXLNA敲除細胞系;在此基礎上檢測TXLNA過表達、敲除分別對于U251細胞及GBM原代細胞的增殖、遷移、侵襲、克隆形成能力和周期分布的影響。使用CCK-8及EdU檢測U251細胞及GBM原代細胞增殖的結果顯示:TXLNA過表達促進膠質瘤細胞的增殖;TXLNA敲除則抑制膠質瘤細胞增殖。克隆形成實驗結果顯示:TXLNA過表達促進膠質瘤細胞克隆形成;TXLNA敲除抑制膠質瘤細胞克隆形成。Transwell實驗結果顯示:TXLNA過表達促進膠質瘤細胞遷移和侵襲;TXLNA敲除抑制膠質瘤細胞遷移和侵襲。流式細胞儀檢測細胞周期實驗結果顯示:TXLNA過表達的膠質瘤細胞G1期細胞的比例顯著減少,G2期細胞的比例顯著增加;TXLNA敲除的膠質瘤細胞G1期細胞的比例顯著增加,G2期細胞的比例顯著減少。在細胞表型實驗基礎上,本研究進一步建立了裸鼠原位成瘤模型,實驗結果顯示:與注射TXLNA野生型膠質瘤細胞的荷瘤裸鼠比較,注射TXLNA敲除的膠質瘤細胞的荷瘤裸鼠生存期顯著延長,表明TXLNA敲除能抑制膠質瘤細胞的體內成瘤能力。綜上所述,本研究在前期通過基因表達譜芯片篩選得到與腦膠質瘤患者預后相關的差異表達基因TXLNA的基礎上,通過TCGA數(shù)據庫生物信息學分析在mRNA水平驗證了TXLNA表達與GBM患者預后的相關性,通過組織芯片結合免疫組化在蛋白水平進一步驗證了TXLNA表達與GBM患者預后的相關性,且證實TXLNA表達是原發(fā)GBM患者OS和PFS的獨立預后危險因素。體外細胞表型實驗證實TXLNA過表達可促進膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲、克隆形成及增高G2期細胞比例;TXLNA敲除抑制膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲、克隆形成及減少G2期細胞比例。裸鼠體內原位成瘤實驗證實腦膠質瘤TXLNA表達水平與荷瘤裸鼠生存期具有相關性,且敲除TXLNA抑制膠質瘤細胞體內成瘤能力。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

基因芯片中預后不同的兩組腦膠質瘤患者差異表達基因聚類熱圖分析

士學位論文結 果TCGA 數(shù)據庫分析結果 TXLNA 在 GBM 與正常腦組織中的表達情況，我們對 TC 樣本及 10 例正常腦組織樣本的基因表達數(shù)據進行基因差XLNA 在 GBM 中表達較正常腦組織中顯著上調（7, p＜0.0001）（圖 2）。 TXLNA 表達與 GBM 患者預后的相關性，我們依據 TXGBM患者分為TXLNA高表達組（n=284）和TXLNA低表達數(shù)據庫中該 528 例 GBM 患者的隨訪數(shù)據，通過 Kaplan-M 表達與 GBM 患者 OS 相關（345 天 vs. 377 天，p=0.0著（p=0.1360）（圖 3）。

結合 TCGA 數(shù)據庫中該 528 例 GBM 患者的隨訪數(shù)據，通過 Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn) TXLNA 表達與 GBM 患者 OS 相關（345 天 vs. 377 天，p=0.0373），與 PFS則相關性不顯著（p=0.1360）（圖 3）。圖 2. TCGA 數(shù)據庫中 GBM 與正常腦組織 TXLNA 表達水平比較
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本文編號：2849878