腦膠質(zhì)瘤(Glioma)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的惡性腫瘤,其中最常見、惡性程度最高的是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)。腦膠質(zhì)瘤最根本、最有效的治療方式是最大范圍安全切除腫瘤輔以術(shù)后放化療。盡管近年來隨著免疫治療、基因治療等新治療方法不斷應(yīng)用,腦膠質(zhì)瘤的治療手段有了較大的進(jìn)步,然而對(duì)其治療并未取得突破性進(jìn)展,GBM患者的5年總生存率僅約5%,中位生存期僅約15個(gè)月。闡明腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,探尋腦膠質(zhì)瘤分子治療靶點(diǎn)是當(dāng)前神經(jīng)腫瘤研究的重點(diǎn)。本研究旨在通過組織芯片技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)TXLNA基因在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)情況及其與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的相關(guān)性,采用分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)方法探索TXLNA基因在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能,為TXLNA基因成為腦膠質(zhì)瘤臨床預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物以及分子靶向治療候選靶點(diǎn)提供依據(jù)。本課題組利用前期的基因表達(dá)譜芯片篩選出與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后顯著相關(guān)的83個(gè)基因,本研究選定TXLNA基因深入研究其對(duì)于GBM預(yù)后判斷的價(jià)值及其在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。首先,我們從TCGA公共數(shù)據(jù)庫(kù)下載了10例正常腦組織樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和528例GBM樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)的臨床資料和隨訪數(shù)據(jù),從中提取TXLNA基因的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析及生存分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GBM中TXLNA表達(dá)量較正常腦組織顯著上調(diào)(7.023±0.032 vs.5.284±0.0718,p0.0001),通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)TXLNA表達(dá)量與患者總生存期(OS)(p=0.0373)相關(guān),與無進(jìn)展生存期(PFS)(p=0.1360)相關(guān)性不顯著。在數(shù)據(jù)庫(kù)中初步驗(yàn)證TXLNA在GBM中表達(dá)上調(diào)且與患者預(yù)后具有相關(guān)性的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步收集了300例腦膠質(zhì)瘤樣本及16例正常腦組織樣本,其中WHOⅠ級(jí)11例,WHOⅡ級(jí)109例,WHOⅢ級(jí)47例,WHOⅣ級(jí)133例;將上述樣本制備成組織芯片,對(duì)其中隨訪數(shù)據(jù)完整的共100例原發(fā)性GBM樣本及16例正常腦組織樣本的免疫組化結(jié)果進(jìn)行判讀評(píng)分并統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)TXLNA在原發(fā)性GBM中表達(dá)較正常腦組織明顯上調(diào)(p=0.0189);將100例原發(fā)性GBM依據(jù)TXLNA免疫組化結(jié)果分為TXLNA高表達(dá)組66例(3分)和TXLNA低表達(dá)組34例(≤3分),通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn),TXLNA表達(dá)與原發(fā)性GBM患者OS(p=0.0006)和PFS(p=0.0001)均具有顯著相關(guān)性,且TXLNA高表達(dá)對(duì)應(yīng)更短的OS和PFS。通過單因素分析將p值0.2的臨床因素進(jìn)一步納入多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型,結(jié)果證實(shí)TXLNA高表達(dá)是原發(fā)GBM患者OS(HR=2.126,95%CI:1.293-3.497,p=0.003)及PFS(HR=2.530,95%CI:1.530-4.184,p0.001)的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素。為了深入探討TXLNA在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。本課題通過構(gòu)建TXLNA基因的過表達(dá)質(zhì)粒,包裝慢病毒后感染U251細(xì)胞和GBM原代細(xì)胞,建立TXLNA穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株;通過構(gòu)建TXLNA敲除質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞和GBM原代細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀分選單克隆建立TXLNA敲除細(xì)胞系;在此基礎(chǔ)上檢測(cè)TXLNA過表達(dá)、敲除分別對(duì)于U251細(xì)胞及GBM原代細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、克隆形成能力和周期分布的影響。使用CCK-8及EdU檢測(cè)U251細(xì)胞及GBM原代細(xì)胞增殖的結(jié)果顯示:TXLNA過表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖;TXLNA敲除則抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TXLNA過表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成;TXLNA敲除抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TXLNA過表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲;TXLNA敲除抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TXLNA過表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞G1期細(xì)胞的比例顯著減少,G2期細(xì)胞的比例顯著增加;TXLNA敲除的膠質(zhì)瘤細(xì)胞G1期細(xì)胞的比例顯著增加,G2期細(xì)胞的比例顯著減少。在細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步建立了裸鼠原位成瘤模型,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與注射TXLNA野生型膠質(zhì)瘤細(xì)胞的荷瘤裸鼠比較,注射TXLNA敲除的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的荷瘤裸鼠生存期顯著延長(zhǎng),表明TXLNA敲除能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。綜上所述,本研究在前期通過基因表達(dá)譜芯片篩選得到與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)基因TXLNA的基礎(chǔ)上,通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)生物信息學(xué)分析在mRNA水平驗(yàn)證了TXLNA表達(dá)與GBM患者預(yù)后的相關(guān)性,通過組織芯片結(jié)合免疫組化在蛋白水平進(jìn)一步驗(yàn)證了TXLNA表達(dá)與GBM患者預(yù)后的相關(guān)性,且證實(shí)TXLNA表達(dá)是原發(fā)GBM患者OS和PFS的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素。體外細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)證實(shí)TXLNA過表達(dá)可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、克隆形成及增高G2期細(xì)胞比例;TXLNA敲除抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、克隆形成及減少G2期細(xì)胞比例。裸鼠體內(nèi)原位成瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)腦膠質(zhì)瘤TXLNA表達(dá)水平與荷瘤裸鼠生存期具有相關(guān)性,且敲除TXLNA抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

基因芯片中預(yù)后不同的兩組腦膠質(zhì)瘤患者差異表達(dá)基因聚類熱圖分析

士學(xué)位論文結(jié) 果TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果 TXLNA 在 GBM 與正常腦組織中的表達(dá)情況，我們對(duì) TC 樣本及 10 例正常腦組織樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因差XLNA 在 GBM 中表達(dá)較正常腦組織中顯著上調(diào)（7, p＜0.0001）（圖 2）。 TXLNA 表達(dá)與 GBM 患者預(yù)后的相關(guān)性，我們依據(jù) TXGBM患者分為TXLNA高表達(dá)組（n=284）和TXLNA低表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中該 528 例 GBM 患者的隨訪數(shù)據(jù)，通過 Kaplan-M 表達(dá)與 GBM 患者 OS 相關(guān)（345 天 vs. 377 天，p=0.0著（p=0.1360）（圖 3）。

結(jié)合 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中該 528 例 GBM 患者的隨訪數(shù)據(jù)，通過 Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn) TXLNA 表達(dá)與 GBM 患者 OS 相關(guān)（345 天 vs. 377 天，p=0.0373），與 PFS則相關(guān)性不顯著（p=0.1360）（圖 3）。圖 2. TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中 GBM 與正常腦組織 TXLNA 表達(dá)水平比較
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