背景及目的:人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤,患者5年生存率不足5%。目前腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制尚不清楚,大量研究表明,血管化是實體腫瘤發(fā)展進程中的重要組成部分,腫瘤的新生血管能夠提供腫瘤生長所需要的氧氣和營養(yǎng),同時清除代謝廢物,促進腫瘤細胞遠端轉(zhuǎn)移。隨著對非編碼RNA研究的不斷深入,越來越多的研究表明,lncRNA在腫瘤血管新生中發(fā)揮著重要作用。lncRNA XIST是在X染色體失活中起重要作用的非編碼RNA,本課題組使用生物信息學方法預測發(fā)現(xiàn)miR-429與XIST存在互補序列,可能是XIST的靶向miRNA。因此,本研究旨在通過一系列分子生物學及細胞功能實驗檢測XIST、miR-429在人腦膠質(zhì)瘤中的表達方式,證明XIST與miR-429的相互作用關(guān)系,探索XIST參與膠質(zhì)瘤成瘤及血管新生的分子機制,為抗血管再生療法治療腦膠質(zhì)瘤提供理論支持。方法:首先,通過分析GEO、CGGA公共數(shù)據(jù)集中膠質(zhì)瘤基因表達譜,探索XIST在不同級別腦膠質(zhì)瘤中的表達情況。通過熒光定量PCR技術(shù),檢測XIST在U251、A172膠質(zhì)瘤細胞及HA1800正常膠質(zhì)細胞中表達情況,證實XIST在膠質(zhì)瘤中的作用。其次,構(gòu)建慢病毒載體,在U251、A172細胞中沉默XIST的表達后,分別采用MTT分析、克隆形成、流式細胞術(shù)、Transwell以及HBMVEC細胞成管等一系列細胞功能學實驗,以及分子生物學實驗檢測XIST對膠質(zhì)瘤誘導的人腦微血管內(nèi)皮細胞HBMVEC增殖、遷移和血管形成能力的影響。通過裸鼠皮下移植瘤實驗驗證XIST對膠質(zhì)瘤成瘤的影響,并對腫瘤進行免疫組化分析,進一步證明下調(diào)XIST的表達對膠質(zhì)瘤血管新生的抑制作用。再次,合成miR-429的mimic、inhibitor、mimic negative control和inhibitor negative control,轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞后檢測miR-429對XIST分子表達的影響。然后通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定miR-429對XIST的靶向作用。最后,將miR-429inhibitor轉(zhuǎn)染到沉默XIST的膠質(zhì)瘤穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中,采用MTT分析、克隆形成、流式細胞術(shù)、Transwell以及HBMVEC細胞成管等一系列實驗檢測XIST對膠質(zhì)瘤誘導的人腦微血管內(nèi)皮細胞HBMVEC增殖、遷移和血管形成能力的作用是否由miR-429介導。結(jié)果:基因芯片數(shù)據(jù)集GSE2223、GSE4290分析結(jié)果表明,XIST在膠質(zhì)瘤組織中的表達顯著高于正常腦組織,這種異常表達主要體現(xiàn)在高級別膠質(zhì)瘤中,而低級別膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織相比差異無統(tǒng)計學意義,暗示XIST的表達與膠質(zhì)瘤的級別無明顯相關(guān)性。而CGGA數(shù)據(jù)集分析結(jié)果表明XIST的表達在原發(fā)和復發(fā)膠質(zhì)瘤組織中明顯不同,XIST在復發(fā)的膠質(zhì)瘤組織中超表達。成功建立膠質(zhì)瘤XIST基因沉默細胞系后,MTT分析、克隆形成實驗、流式細胞術(shù),證明了XIST對膠質(zhì)瘤細胞增殖、克隆形成的促進作用,Transwell以及HBMVEC細胞成管實驗證明了XIST對膠質(zhì)瘤細胞誘導的HBMVEC遷移和成管的促進作用,提示XIST能夠促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖及血管新生。其次裸鼠皮下移植瘤實驗驗證了XIST對膠質(zhì)瘤成瘤的促進作用,瘤體免疫組化分析進一步證明了XIST分子對膠質(zhì)瘤血管新生的促進作用。熒光定量PCR結(jié)果顯示A172、U251膠質(zhì)瘤細胞中miR-429的表達顯著低于正常膠質(zhì)細胞,檢測沉默XIST的膠質(zhì)瘤細胞中miR-429的表達水平后發(fā)現(xiàn),與對照組相比沉默XIST能夠顯著增加細胞中miR-429的量。另外,細胞瞬轉(zhuǎn)miR-429mimic能夠顯著降低XIST的表達量,而miR-429 inhibitor能夠顯著增加XIST的表達量,證明lncRNA XIST與miR-429在膠質(zhì)瘤中的表達成負相關(guān)。通過生物信息學軟件預測了兩者之間的靶序列,并構(gòu)建包含靶序列的野生型pmir GLO-WT-Luc載體以及突變型載體pmir GLO-MUT-Luc,通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測lncRNA XIST與miR-429的靶向關(guān)系。miR-429 mimic、pmir GLO-WT共轉(zhuǎn)染能夠顯著降低細胞內(nèi)的熒光素酶活性,且各對照組細胞內(nèi)的熒光素酶活性沒有明顯變化,證明lncRNA XIST直接通過73045083-73045062序列靶向miR-429而實現(xiàn)對miR-429的調(diào)控作用。將miR-429inhibitor轉(zhuǎn)染到沉默XIST的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A172sh-XIST、U251 sh-XIST細胞系中,發(fā)現(xiàn)miR-429 inhibitor上調(diào)了A172 sh-XIST、U251sh-XIST細胞中被沉默的XIST分子水平,并且在一定程度上恢復了兩個穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞增殖、克隆形成以及血管新生能力。結(jié)論:lncRNA XIST在膠質(zhì)瘤細胞系及組織中高表達,且在復發(fā)的膠質(zhì)瘤組織中超表達,提示基于XIST的治療方案可能對復發(fā)膠質(zhì)瘤更有效。沉默XIST能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤成瘤及血管新生,表明XIST在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。XIST能夠靶向抑制miR-429水平,是miR-429的“分子海綿”。膠質(zhì)瘤中XIST高表達抑制miR-429分子水平,進而誘導人腦微血管內(nèi)皮細胞HBMVEC增殖、遷移和血管形成能力。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.4
【部分圖文】：

lncRNA的分類及結(jié)構(gòu)

10圖 1.2 lncRNA 在膠質(zhì)瘤中的調(diào)控作用Fig 1.2 Functional roles of lncRNAs in glioma1.1.4 lncRNA 在膠質(zhì)瘤中的臨床轉(zhuǎn)化前景（1）lncRNA 與膠質(zhì)瘤的診斷和預后lncRNA 在正常組織與腫瘤組織之間、不同級別的腫瘤之間表達均有所差異，這

吉 林 大 學 博 士 學 位 論 文接著，我們對 CGGA 公共數(shù)據(jù)集 CGGA1 及 CGGA2 進行分析。將 CGGA01 例樣本去除無意義數(shù)據(jù)后按照 WHO 標準分為病理 II 期（包括 A，O，OI 期（包括 AA，AO，AOA，）及病理 IV 期（GBM），各分期相對應的復發(fā)組 r（recurrence）表示。如圖 2.2A 所示，lncRNA XIST 在復發(fā)的膠質(zhì)瘤組織中著高于原發(fā)膠質(zhì)瘤組織（P<0.05）。而對 CGGA2 數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果表明 X組和復發(fā)組之間的表達存在著明顯差異（P<0.05）。
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本文編號：2848679