目的惡性腫瘤是危害人類生命健康的疾病之一,它的發(fā)病以及進展的機制研究已成為當前醫(yī)學領域的重大研究方向�？勺兗艚邮且环N常規(guī)的生物學過程,是產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的原因,它的紊亂可以引起包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生。近年來的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤轉(zhuǎn)錄組中出現(xiàn)大量可變剪接方式的改變,這種改變能夠?qū)е履[瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥。然而,這種可變剪接的改變及其在腫瘤中的重要性,僅僅處于研究的初步階段。因此,全面了解可變剪接潛在的功能能夠幫助我們發(fā)現(xiàn)新的致癌機制以及治療靶點。研究發(fā)現(xiàn)Intersectin1(ITSN1)蛋白與腫瘤密切相關,據(jù)報道ITSN1蛋白表達受選擇性剪接高度調(diào)控:在前體m RNA(pre-m RNA)形成成熟m RNA的過程中,能夠產(chǎn)生兩種亞型:短亞型(ITSN1-S)和長亞型(ITSN1-L)。本研究通過分析膠質(zhì)瘤樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)ITSN1通過選擇性剪接產(chǎn)生的兩種亞型在腫瘤組織和正常組織中的表達出現(xiàn)異常:ITSN1-L的m RNA在膠質(zhì)瘤組織中低表達并且與膠質(zhì)瘤惡性進展呈負相關;而ITSN1-S與其恰恰相反。本課題組前期已對ITSN1-S在膠質(zhì)瘤中的功能進行了深入的研究,它可以作為促癌蛋白促進膠質(zhì)瘤的惡性進展,但關于ITSN1-L在膠質(zhì)瘤中的功能尚未有報道�；诖爽F(xiàn)狀,本課題組開展了ITSN1-L在膠質(zhì)瘤進展中的功能研究,比較兩亞型之間的功能差別,并探索ITSN1-L抑制膠質(zhì)瘤進展的具體分子機制。此項研究是一個全新的發(fā)現(xiàn),不僅補充了ITSN1-L亞型在膠質(zhì)瘤中的功能研究,還為從選擇性剪接的方向調(diào)節(jié)惡性膠質(zhì)瘤進展提供了實驗支持,并為研究以及尋找治療疾病的有效靶點提供了切入點,有望為惡性膠質(zhì)瘤的治療開拓新的思路和方向。方法一、臨床樣本中ITSN1亞型的表達、意義及生物信息學分析1.本研究選取癌癥基因圖譜庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中具有完整隨訪信息的5例正常腦組織和673例膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),統(tǒng)計分析并比較ITSN1-L的表達、ITSN1-S的表達及兩轉(zhuǎn)錄本的表達比值與組織學級別的關系;Kaplan-Meier(K-M)分析ITSN1-L及兩亞型比值的表達與膠質(zhì)瘤患者預后的關系。2.分析ITSN1-L高低表達樣本間的差異基因(Differential expression genes,DEGs);隨后,利用DAVID在線分析工具對DEGs進行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析,并對其進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能富集分析;依據(jù)ITSN1-L的表達對膠質(zhì)瘤樣本進行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)。二、ITSN1兩亞型對膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響1.構建敲降ITSN1-S、過表達全長ITSN1-L及其關鍵結構域的膠質(zhì)瘤細胞系,利用Brd U、ATP法、SRB法及三維克隆增殖實驗檢測細胞的增殖能力。2.運用Crisper/Cas9技術構建ITSN1基因敲除膠質(zhì)瘤細胞系;構建過表達ITSN1-S、過表達ITSN1-L及其關鍵結構域的ITSN1敲除膠質(zhì)瘤細胞系,通過細胞增殖實驗檢測細胞的增殖能力。3.利用裸鼠皮下移植瘤模型,測量各移植瘤的瘤體大小,并對移植瘤組織切片行Ki67免疫組化染色(S-P法)。三、ITSN1兩亞型對膠質(zhì)瘤細胞遷移侵襲的影響及ITSN1-L抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移侵襲的分子機制1.通過劃痕實驗、Transwell遷移及侵襲實驗檢測ITSN1兩亞型對膠質(zhì)瘤細胞遷移侵襲能力的影響;對裸鼠皮下移植瘤組織切片行HE(Hematoxylin-Eosin)染色;分析TCGA數(shù)據(jù)庫中ITSN1-L高低表達膠質(zhì)瘤樣本間侵襲相關差異基因,并通過q RT-PCR驗證細胞中相應基因的m RNA水平。2.利用免疫沉淀體外富集并銀染、質(zhì)譜檢測ITSN1-L相互作用蛋白,并進行驗證;Western blot及免疫熒光檢測細胞中ac-tubulin的表達;Nocodazol處理細胞后,利用免疫熒光檢測微管的穩(wěn)定性。3.構建穩(wěn)定降表達HDAC6和SIRT2的膠質(zhì)瘤細胞系,通過Tubacin藥物洗脫實驗檢測細胞中ac-tubulin的累積速率及去乙�；那闆r,并利用細胞功能學實驗檢測提高ac-tubulin的表達(降表達HDAC6或者Tubacin處理)后對膠質(zhì)瘤細胞遷移侵襲能力的影響。四、ITSN1-L影響膠質(zhì)瘤細胞粘附的關鍵結構域及分子機制1.利用Adhesion、Detachment和Aggregation實驗檢測ITSN1-L對膠質(zhì)瘤細胞粘附的影響并尋找其關鍵結構域;利用免疫熒光、Western bolt、q RT-PCR檢測細胞與胞外基質(zhì)粘附分子和細胞間粘附分子及相應轉(zhuǎn)錄因子的變化情況。2.利用免疫共沉淀驗證ITSN1-L與ANXA2的相互作用;構建穩(wěn)定降表達ANXA2的膠質(zhì)瘤細胞系,通過Western blot和q RT-PCR檢測N-cadherin及相關轉(zhuǎn)錄因子的表達情況,同時利用粘附功能學實驗檢測膠質(zhì)瘤細胞的粘附能力。3.利用免疫共沉淀驗證ITSN1-L與TUBB的相互作用;Western blot及q RT-PCR檢測腫瘤細胞中TUBBs的表達情況;構建穩(wěn)定降表達TUBB3和TUBB4的膠質(zhì)瘤細胞系,通過Western blot檢測N-cadherin的表達情況,利用Aggregation實驗檢測細胞間的粘附情況,通過免疫熒光檢測N-cadherin的定位變化。結果一、臨床樣本中ITSN1亞型的表達、意義及生物信息學分析1.相對于正常組織,ITSN1-L的m RNA在膠質(zhì)瘤中低表達并隨組織學級別的升高而降低,ITSN1-S的m RNA在膠質(zhì)瘤中高表達,ITSN1-S與ITSN1-L的m RNA表達比值隨組織學級別的升高而升高。2.K-M生存分析結果顯示ITSN1-L低表達患者的總生存期(Overall survival,OS)明顯縮短(P0.001);ITSN1-S與ITSN1-L的m RNA表達比值高的患者OS明顯縮短(P0.001)。3.GO功能富集分析結果顯示:ITSN1-L高低表達樣本間的差異基因能夠參與細胞連接、膠原代謝、細胞外基質(zhì)的重構以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等生物學過程;KEGG通路富集結果顯示:差異基因大多集中在黏著斑、間隙連接、ECM受體相互作用等信號通路;GSEA結果顯示:ITSN1-L可能參與細胞的粘附、遷移以及微管相關運動功能。二、ITSN1兩亞型對膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響1.增殖實驗結果顯示:敲降ITSN1-S顯著降低膠質(zhì)瘤細胞的增殖,而過表達ITSN1-L或其關鍵結構域(DH-PH-C2)不影響膠質(zhì)瘤細胞的增殖。2.成功構建過表達ITSN1-S、ITSN1-L及其關鍵結構域(DH-PH-C2)的ITSN1敲除細胞系,增殖實驗顯示:敲除ITSN1抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖,過表達ITSN1-S能夠促進敲除細胞增殖,而過表達ITSN1-L全長以及其關鍵結構域不影響敲除細胞的增殖。3.裸鼠皮下成瘤實驗發(fā)現(xiàn):ITSN1-S能夠促進膠質(zhì)瘤細胞在裸鼠體內(nèi)成瘤,而ITSN1-L不影響其體內(nèi)成瘤;IHC顯示移植瘤中Ki67的表達無統(tǒng)計學差異。三、ITSN1兩亞型對膠質(zhì)瘤細胞遷移侵襲的影響及ITSN1-L抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移侵襲的分子機制1.功能學實驗結果表明:過表達全長ITSN1-L或者降表達ITSN1-S能夠抑制細胞遷移侵襲運動能力;ITSN1-L的C2結構域過表達的細胞的遷移侵襲能力顯著受到抑制,過表達ITSN1-L的DH-PH結構域的細胞的遷移侵襲能力未受影響,在ITSN1敲除細胞系中也得到類似的結果。2.對裸鼠皮下移植瘤組織切片行HE染色,發(fā)現(xiàn)HA-DH-PH-C2/LN229(6/28)和HA-C2/LN229(3/20)組移植瘤組織的侵襲頻率低于對照組(16/30)。3.熱圖顯示TCGA膠質(zhì)瘤樣本中ITSN1-L低表達組的MMP2與MMP9的表達水平幾乎是高表達組的2倍;q RT-PCR結果顯示,ITSN1-L的C2結構域過表達細胞中MMP2及MMP9的m RNA水平顯著低于對照組。4.免疫共沉淀結果顯示ITSN1-L與α-tubulin存在相互作用;Western blot及免疫熒光結果表明:ITSN1-L的C2結構域過表達細胞的ac-tubulin/α-tubulin水平顯著低于對照組細胞。5.穩(wěn)定降表達HDAC6或Tubacin處理組中ac-tubulin的表達顯著升高,降表達SIRT2組中ac-tubulin的表達無明顯變化;Tubacin處理不同時間后,兩組細胞的ac-tubulin的累積速率無統(tǒng)計學差異,而Tubacin藥物洗脫實驗顯示,ITSN1-L的C2結構域過表達組細胞的去乙�；俾士臁�6.免疫熒光結果顯示,Nocodazol處理細胞45 min后ITSN1-L的C2結構域過表達組細胞中ac-tubulin/α-tubulin的表達量低于對照組。7.降表達HDAC6或者Tubacin處理后能提高膠質(zhì)瘤細胞遷移侵襲運動能力。四、ITSN1-L影響膠質(zhì)瘤細胞粘附的關鍵結構域及分子機制1.粘附實驗結果顯示:與對照組相比,ITSN1-L C2結構域過表達組細胞與基質(zhì)之間的粘附能力降低。EGF刺激不同時間后,ITSN1-L C2結構域過表達組細胞p-FAK和p-integrinβ3的相對含量明顯低于對照組。2.功能學實驗表明ITSN1-L C2結構域過表達細胞間粘附能力增強。熱圖顯示ITSN1-L高表達組樣本中CDH2(N-cadherin)的表達水平顯著高于低表達組。Western blot和q RT-PCR顯示,C2結構域過表達細胞中N-cadherin、Snail、Slug、Twist的表達升高,且N-cadherin和β-catenin在細胞膜上存在共定位,而對照組細胞中N-cadherin和β-catenin在細胞漿中呈彌漫性分布。3.免疫共沉淀結果顯示ITSN1-L可與ANXA2蛋白相互作用;降表達ANXA2后細胞中N-cadherin、Snail、Slug、Twist的表達相應降低,細胞間粘附能力降低,同時細胞與基質(zhì)之間的粘附能力提高。4.免疫共沉淀證實ITSN1-L與β-tubulin存在相互作用;Western blot和q RT-PCR顯示ITSN1-L C2結構域過表達細胞中TUBB3和TUBB4的表達水平顯著高于對照組;降表達TUBB3或TUBB4細胞后N-cadherin的表達未受影響,但N-cadherin的細胞膜定位比例降低,同時細胞間的粘附能力降低。結論1.通過對678例膠質(zhì)瘤樣本分析發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤的惡性進展中存在ITSN1的可變剪接方式的改變,并分析了ITSN1兩個亞型的臨床意義:ITSN1-L的m RNA表達與膠質(zhì)瘤患者的預后負相關;ITSN1-S與ITSN1-L m RNA的表達比值與患者的預后正相關。2.膠質(zhì)瘤細胞系及ITSN1敲除細胞系的細胞功能學實驗和裸鼠體內(nèi)移植瘤模型均證實,ITSN1兩亞型對膠質(zhì)瘤細胞的增殖影響不同:ITSN1-L不影響膠質(zhì)瘤細胞的增殖,而ITSN1-S能夠促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖。3.體內(nèi)體外實驗均證實,ITSN1兩亞型在膠質(zhì)瘤細胞遷移侵襲方面的功能截然相反:ITSN1-L的C2結構域能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞的遷移、侵襲;而ITSN1-S與之相反。4.ITSN1-L的C2結構域能與微管蛋白α-tubulin結合,激活HDAC6依賴的ac-tubulin去乙�；^程,破壞微管穩(wěn)定性,從而抑制膠質(zhì)瘤細胞的運動。5.ITSN1-L的C2結構域一方面可以通過抑制FAK/integrinβ3途徑削弱細胞與胞外基質(zhì)之間的粘附;另一方面能通過ANXA2上調(diào)N-cadherin表達,并由TUBB3/4介導N-cadherin從胞漿到胞膜的轉(zhuǎn)位,從而增加細胞間的粘附。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.41
【部分圖文】：

并且在膠質(zhì)瘤中的表達隨著組織學級別的升高而降低（Grade IV <Grade III <Grade II）（圖1.1A），即與組織學級別呈負相關 相比之下，ITSN1-S 的 mRNA 水平在膠質(zhì)瘤組織中高表達（圖 1.1B） 另外，膠質(zhì)瘤樣本中 ITSN1-S 與 ITSN1-L mRNA的表達比值隨著組織學級別的升高而升高（Grade IV <Grade III <Grade II）（圖1.1C） 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ITSN1-S 可作為一種促癌蛋白促進膠質(zhì)瘤的惡性進展，這些結果進一步驗證了本課題組已有的結論，并且初步

天津醫(yī)科大學博士學位論文1.2.2 ITSN1 亞型的表達與膠質(zhì)瘤患者預后的關系接下來，本研究進一步分析了 ITSN1-L 的 mRNA 表達水平與膠質(zhì)瘤患者生存的相關性 圖 1.2A 顯示，ITSN1-L 高表達患者擁有更長總生存期（OS），預后更好 并且，ITSN1-S 與 ITSN1-L 表達比值低的患者擁有更長的 OS 和更好的預后（圖 1.2B） 總之，K-M 生存分析結果表明 ITSN1-L 高表達與膠質(zhì)瘤患者良好的預后和生存相關

圖 1.3 ITSN1-L 功能富集分析 A：通過 DAVID 對差異基因進行 GO 功能注釋；B：通過 DAVID 對差異基因進行 KEGG 通路分析；C：GSEA 對膠質(zhì)瘤臨床樣本的基因進行 GO 功能注釋；Y軸代表 GO 注釋，X 軸代表每個注釋的-log10(q value)，BP：生物學進程，CC：細胞成分，MF：分子功能 1.3 討論1.3.1 選擇性剪接調(diào)控 ITSN1 的表達可能影響膠質(zhì)瘤進展據(jù)報道 ITSN1 蛋白表達受選擇性剪接高度調(diào)控 在 ITSN1 mRNA 成熟的過程中，如果剪接體未發(fā)生跳躍，將 29 號和 30 號外顯子首尾相接，在它們的連接處能提前引入一個終止密碼子，使翻譯提前終止，便產(chǎn)生短亞型（ITSN1-S）；如若剪接體選擇性地跳過了 30 號外顯子，將 29 號外顯子和 31 號外顯子連接在一起，則使翻譯繼續(xù)進行，從而產(chǎn)生了長亞型（ITSN1-L）[10,18] 除此之外，在人類和小鼠中還發(fā)現(xiàn)四類影響 ITSN1 mRNA 成熟的選擇性剪接，包括：（1）外
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本文編號：2848029